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大肠杆菌多重耐药调控基因rob的克隆与表达

作　者: 刘玉堂
导　师: 马红霞
学　校: 吉林农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 大肠杆菌多重耐药 rob 克隆巴斯德毕赤酵母
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用,但是随着抗生素的不恰当使用,由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加,大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高频率、高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE等主动外排系统,其中AcrAB-TolC外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。AcrAB-To1C包括药物质子转运子AcrB、间质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC。AcrAB的表达水平受多种调控因子的调节,如acrR、marA、mppA、sdiA、rob和soxS等,其中,rob是其中的一个正向调控因子。选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922,分别以其染色体DNA为模板,通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob片段,将上述基因片段分别与克隆载体pMD18-T simple Vector连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明:不同动物源性大肠杆菌的rob基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性较高,核苷酸序列同源性在98.7%～99.9%,氨基酸同源性在98.6%～100.0%。rob基因突变位点是否影响了rob对AcrAB-Tolc外输泵的调控作用,进而影响其多重耐药水平,还有待进一步研究。将重组质粒pMD18-T-rob和pPICZαA分别用KpnI和XbaI酶切后构建成表达质粒pPICZαA-rob,构建后的重组质粒电转化进GS115酵母感受态细胞中,阳性重组子甲醇诱导、目的基因酵母表达条件的优化(甲醇浓度、诱导时间、诱导起始OD₆₀₀值等)以及发酵上清浓缩液的SDS-PAGE电泳分析结果表明大肠杆菌多重耐药调控基因rob在毕赤酵母中能够表达,表达的目的蛋白的分子量约为33kDa,与预测的分子量大小相符。本试验获得的临床分离大肠杆菌多重耐药调控基因rob的核苷酸序列同源性比较分析结果,可为深入研究其AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考;获得的rob基因表达蛋白,将为进一步制备其抗体,建立快速有效的该基因表达水平检测方法,阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-9
前言  9-10
第一部分文献综述  10-21
  综述一大肠杆菌耐药分子机制  10-16
    1 抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生  10-12
    2 酶对抗生素的修饰和破坏  12-14
    3 细菌细胞膜通透性改变使抗生素不易或无法进入细胞内  14
    4 增加抗菌药物从大肠杆菌向细胞外的主动排出  14-16
  综述二大肠杆菌AcrAB-TolC系统研究进展  16-21
    1 AcrAB-TolC系统的结构及功能  16-17
    2 AcrAB-TolC系统的药物外排机制  17
    3 AcrAB-TolC系统的调控机制  17-21
第二部分实验部分  21-51
  实验一大肠杆菌多重耐药调控基因rob的克隆与序列分析  21-34
    1 材料  21-24
    2 方法  24-28
    3 结果  28-31
    4 讨论  31-34
  实验二大肠杆菌多重耐药调控基因rob的毕赤酵母表达  34-51
    1 材料  34-36
    2 方法  36-43
    3 结果  43-45
    4 讨论  45-51
结论  51-52
参考文献  52-57
附录  57-63
致谢  63-64
作者简介  64

大肠杆菌多重耐药调控基因rob的克隆与表达

内容摘要

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