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外排泵ABC转运白基因msbA和spab在幽门螺杆菌多重耐药中的作用

作　者: 米阳
导　师: 郑鹏远
学　校: 郑州大学
专　业: 内科学
关键词: 多重耐药外排泵 msbA spab 幽门螺杆菌 ABC 耐药株细菌耐药转运蛋白抗生素敏感株二倍稀释法菌体琼脂糖克拉霉素野生株菌株敏感性培养基 Helicobacter
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)在人群中感染率在40-90%,它是慢性胃炎、消化性溃疡和胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤的主要病因,并与胃癌的发生密切相关.临床中常联合应用抗生素对幽门螺杆菌进行根除治疗.随着抗生素的广泛应用,幽门螺杆菌的耐药率逐年上升,并且已经出现同时对阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑耐药的多重耐药(multi-drug resistance)株.目前针对细菌多重耐药的机制研究已成为细菌耐药性研究中的热点问题.其中,细菌外排泵(efflux pump)在多重耐药中起重要作用。外排泵是细菌体内能将有害底物泵出体外的一类转运蛋白,可分为5个家族。国内外和我们前期对RND类外排泵在幽门螺杆菌多重耐药中作用的机制研究已有报道,但对于ABC转运蛋白基因在幽门螺杆菌多重耐药株中的表达及其作用尚需进一步研究.本研究在我们前期研究的基础上,从GenBank筛选出ABC转运蛋白家族基因中的两个典型的多重耐药蛋白基因msbA和spab,测定其在幽门螺杆菌多重耐药株中的表达,并构建对应的基因敲除株,测定敲除前后对应菌株对各种抗生素的敏感性,研究两种基因在幽门螺杆菌多重耐药中的作用.进一步阐明在幽门螺杆菌多重耐药起作用的外排泵的种类和意义,为临床上幽门螺杆菌多重耐药的研究打下理论基础。方法1.从临床胃炎和消化性溃疡病人胃粘膜标本分离培养出幽门螺杆菌野生菌株,测定菌株对各种抗生素的MIC。2.应用氯霉素在敏感野生株中诱导出对应的幽门螺杆菌多重耐药株,并采用琼脂二倍稀释法测定敏感株和多重耐药菌株对各种抗生素的MIC。3.PCR检测幽门螺杆菌野生株中msbA和spab基因的表达。4.应用RT-PCR分别测定msbA和spab基因在野生敏感株和诱导多重耐药株中的表达。5.分别构建msbA和spab的基因敲除株,并测定基因敲除前后对9种抗生素的MIC。结果1.成功从临床上分离培养出幽门螺杆菌野生株50株。将临床分离的4株敏感株和标准株HpNCTC 11637经氯霉素诱导,成功诱导出对应的多重耐药株5株,经琼脂二倍稀释法测定5株多重耐药株对氨苄西林、头孢菌素、四坏素、克拉霉素、氧氟沙星和呋喃哗酮的MIC相对于敏感株均有不同程度的提高。2.随机选择20株临床分离株,均检测出msbA和spab基因,大小分别为303bp和424bp,未发现两种基因的缺失株。3.多重耐药株中msbA和spab基因的相对表达量明显高于野生敏感株(msbA:多重耐药株1.8200±0.5310 vs敏感株0.8420±0.0789,P=0.018；spab多重耐药株1.8340±0.2726 vs敏感株1.2180±0.0743,P=0.015)。4.成功构建了msbA和spab的基因敲除株(HpMZ1006△msbA和HpMZ1006△spab)。HpMZ1006△msbA和HpMZ1006△spab对于四种抗生素(克拉霉素、氯霉素、氧氟沙星和利福平)的MIC相对敲除前野生株有明显下降。结论1.在氯霉素的长期次抑菌浓度诱导下,敏感的幽门螺杆菌菌株转变为多重耐药菌株,说明抗生素的长期滥用和剂量不足会导致耐药菌株的产生。2.ABC转运蛋白msbA和spab基因在幽门螺杆菌中普遍存在。3.ABC转运蛋白msbA和spab基因在幽门螺杆菌多重耐药机制中起重要作用。4.首次阐明了在幽门螺杆菌多重耐药机制中,除了RND家族外排泵起作用之外,还有ABC转运蛋白外排泵家族参与其中。5.由于ABC转运蛋白外排泵家族在能量来源与其他外排泵家族不同,为以后新型外排泵抑制剂的研发提供了理论基础。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-11
前言  11-14
材料与方法  14-37
结果  37-49
讨论  49-54
小结  54-55
参考文献  55-58
综述部分细菌外排泵系统和ABC 转运蛋白在细菌多重耐药中的作用  58-68
  参考文献  64-68
附录部分  68-70
  英文缩略词表  68-69
  个人简历  69-70
  致谢  70

外排泵ABC转运白基因msbA和spab在幽门螺杆菌多重耐药中的作用

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