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Neuregulin-1在大鼠急性视神经损伤后的表达及其保护作用的实验研究

作　者: 冯灵美
导　师: 蔡季平；魏锐利；李由
学　校: 第二军医大学
专　业: 眼科学
关键词: NRG-1 视神经损伤神经保护凋亡
分类号: R779.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的神经再生,尤其是中枢神经系统(包括视神经)的再生一直以来是神经科学研究的重要课题,急性视神经损伤是眼外伤中常见的损伤,临床一般采取保守治疗及视神经管减压术,大多效果欠佳,目前尚无特效治疗药物。Neuregulin-1(NRG-1)有助于促进神经轴突向靶向区域的扩展和在这些区域突触的发生,使成熟的皮质神经元网络能够广泛地改型,并且能够使促进神经元分化的因子(如神经生长因子)在成熟脑中表现出对突触再生的重要作用,NRG-1和它的ErbB受体还可促进了成熟神经元的连接。近年来研究发现神经变性过程中不同的NRG-1水平变化和这些水平的相互平衡及其他神经营养因子均可发挥重要作用。本研究拟建立大鼠急性视神经钳夹损伤模型,确立视神经受损后视网膜组织中不同时间NRG-1表达的情况,并在大鼠视神经损伤后将不同的剂量的NRG-1注入玻璃体腔内,研究NRG-1是否对视神经急性损伤有保护和修复作用,并以此推测视神经急性损伤的可能机理。方法实验一:二月龄SD雄性大鼠48只;随机分为假手术组(n=24)和手术组(n=24);假手术组对照组,手术组为对照组,为所有实验动物左眼为手术眼,右眼不做任何处理。钳夹伤后2h、1d、2d、7d、14d、28d各组行闪光视诱发电位(flashvisual evoked potential,FVEP)检查及眼底照相定性观察视神经受损情况,并于钳夹伤后2h、1d、2d、7d、14d、28d后处死动物,取眼球和视神经,用组织病理检查和免疫组化等技术来观察和评价视网膜组织内NRG-1表达水平。实验二:二月龄SD雄性大鼠100只。随机分为NRG-1治疗组(n=60):分别于急性视神经损伤后玻璃体腔内一次性注入NRG-1 0.5ug、1ug、3ug(各组n=20);生理盐水对照组(n=20):于急性视神经损伤后玻璃体腔内一次性注入相同体积的生理盐水;阴性对照组(n=20):于急性视神经损伤后不做任何处理。所有实验动物左眼为手术眼,右眼不做任何处理;然后于1d、2d、7d、14d、28d各组行FVEP检查及眼底照相定性观察视神经受损及修复情况并分别处死部分动物,用组织病理检查、TUNEL原位凋亡检测等技术来观察和评价视网膜神经节细胞的数目及进行各组间视网膜神经节细胞凋亡数目的比较。结果实验一:1.造模后的形态、电生理及病理观察眼底照相:假手术组眼底与正常眼无明显差别;急性视神经钳夹伤后2h-7d眼底像上与正常相比尚无明显差别,至2w时视盘逐渐变苍白,4w时苍白程度基本定型。FVEP:手术组夹伤后2h即出现异常波形,表现为低平扁阔及不规则形,潜伏期延长,P100波幅降低;随后几天稍有恢复,但仍低于正常振幅的50%,P100波振幅及其潜伏期在损伤后各时间点与假手术组相比有统计学差异,t检验P＜0.05。HE染色:假手术组视网膜轻度水肿增厚,胞核数量及排列无明显改变;手术组2h视网膜的组织学变化主要表现为视网膜组织的水肿,其中以神经纤维层与内网状层的水肿最明显,厚度增加明显,染色较淡;1-2d视网膜水肿基本消失,视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)数目减少,细胞变性,神经纤维层明显变薄,内核层细胞排列紊乱,外核层变化变薄;7-14d后视网膜内层明显变薄;至4w时变化不再明显。2.NRG-1表达情况与假手术组大鼠相比,大鼠急性视神经损伤后2h、1d、2d、7d、14d各时点视网膜的NRG-1表达量均明显增加(P＜0.05);其中,损伤后14d时NRG-1的表达量升高最为明显,达到峰值;然后逐渐下降至损伤后28d,与假手术组大鼠视网膜组织相比,NRG-1的表达差异无统计学意义(P＞0.05)。实验二:眼底照相:损伤2h-7d各组眼底尚无明显变化,至2周时阴性对照组和生理盐水对照组视盘苍白;NRG-1治疗组与之相比未见明显改变。FVEP:NRG-1组与对照组的FVEP波振幅值在伤后第一天均降至最低水平,以后逐渐恢复,从各点的差异来看,14天时表现最显著(P＜0.05)。P100波潜伏期比较,NRG-1 0.5ug组与生理盐水组相比,各时间点潜伏期时间虽有缩短,但无统计学意义(P＞0.05);NRG-1 1ug组除在1天时间点与生理盐水组相比无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点与生理盐水组相比有统计学意义(P＜0.05),其中尤以14d和28天两时间点与生理盐水组相比有显著统计学差异(P＜0.01);3ug组各时间点与生理盐水组相比有统计学意义(P＜0.05),其中尤以2天、7天、14天和28天时间点与生理盐水组相比有显著统计学差异(P＜0.01)。HE染色:阴性对照组与生理盐水对照组视网膜表现相似:视网膜RGCs排列明显稀疏,大量RGCs出现核碎裂和染色质边聚,有空泡变性,神经纤维层明显变薄。NRG-10.5ug组HE染色组从形态观察类似于生理盐水组;NRG-1 1ug组、3ug组表现相似:视网膜RGCs排列较稀疏,RGCs形态尚正常,细胞间可见较多Muller纤维,可见空泡变性,神经纤维层逐渐变薄。RGCs计数发现,视神经损伤后2周内治疗组与对照组的RGCs数量随时间的推移均不断减少,但7至14天各时间段治疗组的RGCs数目均高于对照组,差异有显著性意义(P＜0.01),这两组和正常对照组相比明显减少,差异也有非常显著性意义(P＜0.01)。TUNEL原位凋亡检测显示,视网膜内凋亡细胞出现在内核层(inner nuclearlayer,INL)及神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL),而外核层(outer nuclearlayer,ONL)几乎无阳性表达。相对于生理盐水组,NRG-1治疗组各个时间点神经节细胞凋亡数目有所减少。视神经组织亦发现有凋亡胶质细胞,呈棕褐色染色。NRG-1 0.5ug组与阴性对照组相比,各时间点凋亡细胞数目无统计学差异(P＞0.05)。1ug组除在1天时间点与生理盐水组相比无统计学意义(P＞0.05)外,其余各时间点与生理盐水组相比有统计学意义(P＜0.05);NRG-1 3ug组各时间点与生理盐水组相比均有统计学意义(P＜0.05),其中尤以7天、14天和28天时间点与生理盐水组相比有显著统计学差异(P＜0.01)。结论1.成功建立大鼠急性视神经损伤模型,通过免疫组织化学方法,观察到了NRG-1在正常大鼠视网膜组织中的表达。大鼠急性视神经损伤后NRG-1蛋白的表达呈先升高后降低的趋势。这些结果提示:NRG-1对于正常大鼠视功能的维持有着一定作用,NRG-1可能参与了视神经损伤的病理变化和自身修复过程。2.NRG-1能有效降低视网膜组织细胞的凋亡数目,并且其保护作用的效果可能与剂量有关。这些结果说明:大鼠急性视神经损伤后,给予NRG-1能降低视网膜神经节细胞的凋亡,说明NRG-1对于急性视神经损伤具有修复和保护作用。3.视神经损伤后,尽量保存视网膜神经节细胞免于凋亡是改善视神经损伤预后的关键。我们的研究结果提示:尽早使用外源性NRG-1等神经保护剂,保护RGCs等神经元,对于损伤后神经再生、进而神经功能的恢复可能有积极作用,有一定的临床应用价值。

全文目录

缩略词表  5-6
中文摘要  6-10
英文摘要  10-14
前言  14-16
第一部分大鼠急性视神经损伤模型的建立及Neuregulin-1的表达  16-34
  材料与方法  16-23
  结果  23-30
  讨论  30-34
第二部分 Neuregulin-1对大鼠急性视神经损伤的保护作用  34-51
  材料与方法  34-38
  结果  38-46
  讨论  46-51
参考文献  51-58
结论  58-59
综述  59-66
附录二  66-67
致谢  67

Neuregulin-1在大鼠急性视神经损伤后的表达及其保护作用的实验研究

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