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稻瘟病菌钙/钙调素依赖蛋白激酶基因功能的研究

作　者: 刘静
导　师: 王立安
学　校: 河北师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 稻瘟病菌 钙/钙调素依赖蛋白激酶 基因敲除 原生质体 转化子 生物学性状 RNA干扰
分类号: S435.111.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本实验室前期研究从稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）PO-41菌株中克隆到两个钙/钙调素依赖蛋白激酶(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase,CaMK)基因,分别命名为MgCaMK1和MgCaMK2。两个基因在基因组中为单拷贝基因。激酶活性实验表明:MgCaMK1为钙/钙调素依赖蛋白激酶,而MgCaMK2为钙依赖蛋白激酶（CDPK）。本研究的主要目的是明确CaMK在稻瘟病菌菌丝生长及致病过程中的作用。主要结果如下:（1）分别构建了稻瘟病菌CaMK1和CaMK2基因敲除载体并进行了验证。（2）利用PEG介导的转化系统将构建好的敲除载体转化到稻瘟病菌原生质体中。CaMK1基因共获得14个转化子。采用潮霉素抗性及PCR技术对转化子进行初筛,获得8个含抗潮霉素基因的转化子。Southern杂交验证表明,7个转化子为异位整合转化子,另一个转化子同源片段不仅没有替换掉目的基因也没有插入到该转化子的基因组DNA中。可能原因:一是PEG介导的转化系统同源重组效率较低,需大量筛选才能得到基因敲除突变子;二是CaMK1在基因组中为单拷贝基因,敲除可能是导致致死突变。对其中两个异位整合的转化子的生物学性状进行了分析。结果表明:转化子K1-1菌落颜色始终为米黄色,其平均生长速率要高于野生型,但是产孢量没有明显差异,孢子萌发时较野生型延迟,且萌发率很低,但24 h后观察有附着胞出现。转化子K1-2生物学性状与野生型无显著差异。（3）构建了稻瘟病菌CaMK1基因RNAi载体。利用PEG介导的转化系统进行转化,目前已获得9个转化子。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-12
前言  12-14
第一部分 文献综述  14-27
  1 稻瘟病菌及其致病过程  14-17
    1.1 稻瘟病菌与稻瘟病  14-15
    1.2 稻瘟病菌侵染寄主的过程  15-17
      1.2.1 孢子附着  15-16
      1.2.2 侵入  16-17
      1.2.3 定殖  17
  2 参与稻瘟病菌附着胞形成的信号转导途径  17-21
    2.1 cAMP 信号途径  18
    2.2 MAPK 信号途径  18-20
      2.2.1 PMK1  19
      2.2.2 MPS1  19
      2.2.3 OSM1  19-20
    2.3 Ca~(2+)信号途径  20-21
  3 蛋白激酶  21-24
    3.1 钙/钙调素依赖的蛋白激酶(CaMK)  22-23
    3.2 真菌中 CaMK 研究进展  23-24
  4 稻瘟病菌致病相关基因研究方法  24-27
    4.1 基因敲除技术(gene knockout)  24-25
    4.2 RNA 干扰技术(RNAi)  25-26
    4.3 转座子标签技术(transposon tagging)  26
    4.4 过表达(over-expression)  26
    4.5 其他技术  26-27
第二部分 研究报告  27-74
  第一章 稻瘟病菌 CaMK1和 CaMK2基因敲除载体构建  27-45
    一 实验材料及实验仪器  27-28
      1 菌株和质粒  27
      2 试剂和培养基  27
        2.1 试剂  27
        2.2 培养基  27
      3 实验仪器  27-28
    二 实验方法  28-33
      1 稻瘟病菌的培养  28
        1.1 固体培养基培养  28
        1.2 液体培养基培养  28
      2 CTAB 法提取稻瘟病菌基因组 DNA  28-29
      3 CaCl_2法制备大肠杆菌细菌感受态  29
      4 质粒的提取(上海生工)  29-30
      5 酶切  30-31
      6 连接  31-32
      7 连接产物的热激转化及转化子的蓝白斑筛选  32
      8 鉴定  32
        8.1 PCR 鉴定  32
        8.2 酶切鉴定  32
      9 PCR 产物、酶切产物的胶回收(上海生工)  32-33
    三 结果及分析  33-42
      1 CaMK1基因敲除载体的构建  33-38
        1.1 CaMK1基因敲除载体的构建策略  33
        1.2 CaMK1基因上游片段的获得  33-35
        1.3 CaMK1基因下游片段的获得  35
        1.4 CaMK1基因敲除载体的第一步重组  35-36
        1.5 CaMK1基因敲除载体的第二步重组  36-37
        1.6 CaMK1基因敲除载体的第三步重组  37-38
      2 CaMK2基因敲除载体的构建  38-42
        2.1 CaMK2基因敲除载体的构建策略  38
        2.2 CaMK2基因上游片段的获得  38-40
        2.3 CaMK2基因下游片段的获得  40
        2.4 CaMK2基因敲除载体的第一步重组  40-41
        2.5 CaMK2基因敲除载体的第二步重组  41-42
        2.6 CaMK2基因敲除载体的第三步重组  42
    四 讨论  42-45
  第二章 稻瘟病菌 CaMK1的转化及转化子分析  45-65
    一 实验材料及实验仪器  45-47
      1 材料  45
      2 试剂和培养基  45-46
        2.1 试剂  45-46
          2.1.1 原生质体制备及转化所用试剂  45
          2.1.2 DNA 提取所用试剂  45
          2.1.3 Southern blot 试剂  45-46
          2.1.4 其他试剂用品  46
        2.2 培养基  46
      3 实验仪器  46-47
    二 实验方法  47-54
      1 稻瘟病菌 CaMK1的转化  47-49
        1.1 稻瘟病菌菌丝球的获得  47
        1.2 稻瘟病菌原生质体的制备  47-48
        1.3 含 CaMK1敲除载体的质粒的提取(参照第一章方法4)  48
        1.4 酶切  48
        1.5 PEG 介导的原生质体的转化  48
        1.6 转化子的抗性初筛  48
        1.7 PCR 鉴定  48-49
      2 Southern blot  49-53
        2.1 提取用于 Southern blot 的稻瘟病菌基因组 DNA  49-50
        2.2 DNA 的酶切  50
        2.3 酶切后 DNA 的电泳、变性及中和  50-51
        2.4 转膜  51
        2.5 探针的制备  51
        2.6 探针的标记(Roche 地高辛标记试剂盒)  51
        2.7 探针标记效率的检测(Roche 地高辛标记试剂盒)  51-52
        2.8 预杂交和杂交(Roche 地高辛标记试剂盒)  52
        2.9 杂交后的洗膜与免疫检测  52-53
      3 生物学性状分析  53-54
        3.1 菌种的活化  53
        3.2 菌丝生长速率的测定  53
        3.3 分生孢子的收集  53
        3.4 分生孢子萌发和附着胞形成的观察  53-54
    三 结果分析  54-61
      1 稻瘟病菌 CaMK1转化子的获得  54-56
        1.1 稻瘟病菌菌丝球被酶消化前后  54
        1.2 获得的用于转化的原生质体  54
        1.3 PEG 介导的转化获得的 CaMK1转化子的情况  54-55
        1.4 转化子 PCR 鉴定结果  55-56
      2 稻瘟病菌 CaMK1转化子的 Southern blot 验证  56-59
        2.1 杂交检测的策略  56-57
        2.2 探针的获得  57
        2.3 探针标记效率的检测  57
        2.4 基因组 DNA 酶切效果检测  57-58
        2.5 Southern blot 验证结果  58-59
      3 转化子 K1-1、K1-2的生物学性状分析  59-61
        3.1 转化子 K1-1、K1-2的菌落形态特征  59-60
        3.2 转化子菌丝生长测定  60-61
        3.3 转化子的产孢量与野生型的比较  61
        3.4 转化子分生孢子萌发及附着孢形成的观察  61
    四 讨论  61-65
  第三章 稻瘟病菌 CaMK1基因 RNAi 载体构建及转化  65-74
    一 实验材料及实验仪器  65-66
      1 菌株及质粒  65
      2 试剂和培养基  65
        2.1 试剂  65
        2.2 培养基  65
      3 实验仪器  65-66
    二 实验方法  66-70
      1 CTAB 法提取稻瘟病菌基因组 DNA(参见第一章方法2)  66
      2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态(参见第一章方法3)  66
      3 质粒的提取(北京天根)  66-67
      4 PCR 产物、酶切产物琼脂糖凝胶回收(北京天根)  67
      5 酶切  67-68
      6 连接  68
      7 将连接体系转入大肠杆菌感受态中(参见第一章方法7)  68
      8 对构建的载体正确性的验证(参见第一章方法8)  68
      9 将构建好的 CaMK1基因 RNAi 载体利用 PEG 介导的转化转入到稻瘟病菌中(参见第二章方法1.5)  68
      10 转化子的抗性初筛(参见第二章方法1.6)  68
      11 转化子生物学性状分析(参见第二章方法3)  68
      12 对性状出现差异的转化子的鉴定  68-70
        12.1 PCR 鉴定(参见第二章方法1.7)  68-69
        12.2 RNA 水平上的鉴定(Trizol 法提取稻瘟病菌总 RNA)  69-70
    三 结果分析  70-73
      1 CaMK1基因 RNAi 载体构建策略  70-71
      2 CaMK1基因 RNAi 载体构建片段的获得  71-72
      3 CaMK1基因 RNAi 载体的第一步重组  72
      4 CaMK1基因 RNAi载体的第二步重组  72-73
      5 PEG 介导的转化获得的转化子情况  73
    四 讨论  73-74
结论  74-75
参考文献  75-84
致谢  84

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害 > 稻瘟病
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