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稻瘟病菌凋亡抑制蛋白基因MoIAP的功能分析及Bcl-2对水花生致病菌蕉斑镰刀菌的影响

作　者: 吕锐利
导　师: 郑小波
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 稻瘟病菌 MoIAP 氧化胁迫 漆酶 过氧化物酶 焦斑镰刀菌 Bcl-2 水花生 致病性
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


在多细胞生物的发育过程中,细胞凋亡是一个必不可少的环节,而且它是一个主动过程,涉及一系列蛋白的激活、表达以及调控等的作用。其中caspase家族、Bcl-2家族以及凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins)家族在凋亡的信号转导中扮演着重要角色。本文主要研究了稻瘟病菌抑制凋亡蛋白基因MoIAP的功能,以及Bcl-2对水花生致病菌蕉斑镰刀菌的影响。前期我们在稻瘟病菌中克隆到了凋亡抑制蛋白基因MoIAP,并且利用酵母系统研究发现,MoIAP具有抗氧化胁迫,推迟衰老及抑制ROS产生的功能。为了进一步了解其在稻瘟病菌中的功能,我们试图将稻瘟病菌MoIAP基因敲除,然而,最终没有获得MoIAP基因的缺失突变体,因此我们认为MoIAP在稻瘟病茵中是必需的。因此,我们利用基因沉默技术获得MoIAP沉默突变体,并且进一步获得MoIAP过量表达突变体。研究结果显示,MoIAP沉默与过量表达突变体产孢量没有变化；MoIAP沉默后不影响生长,但过表达可以显著提高生长速率；MoIAP对胞外漆酶和过氧化物酶起负调控作用；沉默MoIAP后会严重影响分生孢子对H202的抗性,而MoIAP过表达后能够抑制H202诱导的细胞死亡；此外,无论是沉默还是过量表达MoIAP,都不影响稻瘟病菌的致病性。为了增加生防真菌的致病性,开发恶性杂草水花生的生防真菌制剂。我们研究了抗凋亡蛋白Bcl-2对水花生致病菌焦斑镰刀菌的影响,将哺乳动物Bcl-2基因通过农杆菌介导法转化蕉斑镰刀茵,获得了B-3、B-6、B-7三个转化子,经常规PCR和半定量RT-PCR检测分析证明Bcl-2基因成功导入到蕉斑镰刀茵中并且表达。对转入Bcl-2基因的焦斑镰刀菌相关性状的分析表明,转入Bcl-2基因的焦斑镰刀茵B-6、B-7与野生型相比,生长速率和生物量没有变化,对各种盐及H202胁迫也没有抗性。然而,B-6、B-7的产孢量较野生型增加,其分生孢子可以抵抗高温胁迫,对水花生的致病性增强。因此,这将为水花生生物防治的研究提供新的思路。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
上篇 文献综述  10-31
  第一章 真菌细胞凋亡的特征、功能及调节  11-23
    1 细胞凋亡  11
    2 细胞凋亡的特征  11-12
      2.1 形态学变化  11-12
      2.2 生物化学变化  12
    3 真菌细胞凋亡的检测  12-13
    4 真菌细胞凋亡的调节  13-14
      4.1 繁殖  13
      4.2 衰老  13-14
    5 真菌细胞凋亡的诱因  14-15
    6 真菌细胞凋亡途径及凋亡基因的功能分析  15-16
    7 自噬  16-17
    参考文献  17-23
  第二章 水花生的危害及其防治  23-31
    1 水花生简介  23-24
      1.1 水花生的分布与繁殖  23
      1.2 水花生的危害  23-24
    2 水花生防治方法  24-26
      2.1 人工防除  24
      2.2 化学防除  24
      2.3 生物防治  24-26
    3 生物工程技术在生物防治中的应用  26-27
    参考文献  27-31
下篇 研究内容  31-61
  第一章 稻瘟病菌凋亡抑制蛋白基因的功能分析  31-49
    1 材料与方法  33-36
      1.1 供试菌株及培养条件  33
      1.2 稻瘟病菌基因组DNA、RNA的提取和cDNA的合成  33
      1.3 稻瘟病菌MoIAP敲除、过量表达及沉默载体的构建和稻瘟病菌原生质体转化  33-34
      1.4 稻瘟病菌MoIAP过量表达和沉默突变体的验证  34-35
      1.5 稻瘟病菌MoIAP过量表达和沉默突变体生长速率与菌丝干重的分析  35
      1.6 胞外漆酶及过氧化物酶活性的检测  35-36
      1.7 分生孢子抗H_2O_2胁迫测定及活性氧检测  36
      1.8 MoIAP过量表达和沉默突变体致病性分析  36
    2 结果  36-45
      2.1 突变体的获得  36-37
      2.2 稻瘟病菌MoIAP沉默和过量表达突变体菌丝生长表型分析  37-38
      2.3 稻瘟病菌MoIAP抗衰老  38-39
      2.4 MoIAP过量表达与沉默突变体分生孢子抑制H_2O_2诱导的细胞死亡  39-42
      2.5 稻瘟病菌MoIAP对胞外漆酶及过氧化物酶活性的影响  42-44
      2.6 稻瘟病菌MoIAP对致病性的影响  44-45
    3 讨论  45-46
    参考文献  46-49
  第二章 Bcl-2对水花生致病菌蕉斑镰刀菌的影响  49-61
    1 材料与方法  50-53
      1.1 供试菌株、植物及培养条件  50
      1.2 载体的构建  50-51
      1.3 转化子的获得与验证  51
      1.4 焦斑镰刀菌DNA、RNA提取和cDNA合成  51
      1.5 生物量测定  51
      1.6 胁迫实验  51-52
      1.7 产孢量测定  52
      1.8 分生孢子耐高温实验  52
      1.9 菌株致病力测定  52
      1.10 叶片离体接种  52-53
    2 结果  53-58
      2.1 转化子的获得  53
      2.2 产孢量增加  53-54
      2.3 分生孢子抗高温胁迫  54-55
      2.4 生物量没有显著变化  55-56
      2.5 对胁迫不敏感  56
      2.6 对水花生的致病性增加  56-58
    3 讨论  58
    参考文献  58-61
附录1  61-62
附录2  62-64
附录3  64-67
攻读硕士学位期间发表的研究论文  67-69
致谢  69

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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