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产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的功能研究

作　者: 钱栋宇
导　师: 胡白石
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业推广
关键词: 产酶溶杆菌生物防治几丁质酶基因基因敲除
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

农业生产上非常重视对植物病害的防治。很多病害的防治主要依赖化学农药,但大量使用化学农药容易污染环境,危害人畜健康,同时导致病原菌杭性不断上升。而生物防治对人畜较安全,对环境污染也少,因此近年来受到了广泛的关注。产酶溶杆菌OH11是从辣椒根际土壤中筛选并分离到的一种新型生防菌株,能产生多种胞外酶,包括几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶和纤维素酶,对多种植物病原物有比较明显的抑制作用,作为生防菌的应用前景十分广阔。真菌的细胞壁由几丁质等物质组成,而OH11可以分泌几丁质酶降解几丁质,从而可以破坏真菌的细胞壁,抑制真菌的生长。因此,几丁质酶可能与OH11的生防作用密切相关。本课题根据已测序获得的OH11基因组信息和几丁质酶基因的序列,构建几丁质酶基因的敲除载体,通过双交换的方法,获得几丁质酶基因缺失突变体。几丁质平板检测显示,突变体△chiA已经完全丧失降解几丁质的能力。southern杂交是验证基因的拷贝数和缺失突变体的一个经典方法。以chiA内部605bp的片段作为探针,采用EcoRI和HindⅢ双酶切的方法,通过southern杂交,我们确定了chiA在OH11中是以单拷贝的形式存在的。以chiA下游518bp的片段作为探针,采用EcoRI和HindⅢ双酶切的方法,通过southern杂交,我们确定了△chiA是chiA缺失突变体。为了确定chiA在OH11生防过程中的作用,我们对几丁质酶基因缺失突变体△chiA和野生型OH11进行了平板拮抗实验。结果显示,△chiA和野生型OH11对6种病原菌的拮抗能力几乎相同。由此我们可以得出结论：chiA不是OH11生防功能的决定性因子。

全文目录

摘要 6-7ABSTRACT 7-9引言 9-10第一部分文献综述 10-28 第一章溶杆菌防治植物病害的研究进展 10-22 1 分类与鉴定 10-12 2 生境及生态学 12-13 3 溶杆菌的拮抗及生防机理 13-22 3.1 胞外酶 13-16 3.2 次生代谢 16-18 3.3 诱导抗性 18-19 3.4 Clp调控的性状 19 3.5 三型泌出系统(T3SS) 19-22 第二章生物防治系统及应用前景 22-28 1 生物防治系统 22-24 2 菌剂创制 24-25 3 前景展望 25-28第二部分研究内容 28-50 第一章产酶溶杆菌OH11几丁质酶基因的敲除 28-40 1 材料与方法 29-37 1.1 材料 29-30 1.2 方法 30-37 2 结果 37-39 2.1 敲除载体构建及验证 37-38 2.2 一次交换子的获得 38 2.3 二次交换子的获得 38 2.4 几丁质平板检测几丁质酶的产生情况 38-39 3 讨论 39-40 第二章产酶溶杆菌OH11几丁质酶基因缺失突变体的southern杂交验证 40-46 1 材料与方法 40-45 1.1 材料 40-41 1.2 实验方法 41-45 2. 结果 45 2.1 chiA在野生型OH11中的拷贝数 45 2.2 突变体△chiA的southern杂交验证 45 3 讨论 45-46 第三章产酶溶杆菌OH11几丁质酶基因缺失突变体的抑菌功能研究 46-50 1 材料与方法 46-48 1.1 材料 46-47 1.2 方法 47-48 2 结果 48 3 讨论 48-50全文总结 50-52参考文献 52-62发表的论文 62-64致谢 64

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的功能研究

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