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蜡梅expansin基因CpEXP2功能初步分析

作　者: 茅允彬
导　师: 李名扬
学　校: 西南大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: expansin 克隆表达载体原核表达
分类号: S685.99
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Expansin基因家族是一类巨大的基因家族,主要分为α-expansm与β-expansin两类,分别都具有很多的基因成员,广泛的存在于多种植物中,目前已有大量的expansin基因被克隆。其所编码的扩张蛋白属于细胞壁酶蛋白,在植物体中表达具有高度的专一性,其表达调控受到植物体自身发育进程、外源激素以及环境因子的调控。研究表明,Expansin基因对植物种子萌发、根系生长、茎、叶片生长发育、果实成熟软化、器官脱落等等方面都起着重要作用,几乎参与了整个植物生长发育过程。本研究在本实验室原有研究基础上,在蜡梅中克隆到了另外一个expansin基因,命名为CpEXP2。构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得了T1代转基因植株;构建了原核表达载体,在大肠杆菌中表达了CpEXP2。主要研究结果如下:1.蜡梅expansin基因CpEXP2的克隆通过随机挑选蜡梅cDNA文库测序,获得了大小为1115bp的cDNA序列,序列分析表明,该基因包含一个771bp的ORF框,编码蛋白长257个氨基酸,BLASTX比对结果显示,与α-expansin的同源性更高,初步推定所获得的cDNA编码Expansin扩展蛋白。命名CpEXP2。2.植物表达载体的构建CpEXP2基因位于文库克隆载体pTriplEx2上,活化菌液并用限制性内切酶SfiI酶切,同时酶切添加了SfiI酶切位点的环状pMD-18TM,回收目的片段和载体并连接,经过酶切和PCR验证,成功构建了克隆载体;再用XbaI和SmaI分别双酶切克隆载体和表达载体pC2301,回收目的片段和表达载体并连接,经酶切和PCR验证,成功构建了含有目的基因的表达载体。3.对拟南芥的遗传转化通过农杆菌介导将含有蜡梅扩张蛋白基因CpEXP2的植物表达载体转入拟南芥中,经过Km+抗性筛选检测,PCR检测,证明CpEXP2基因已经初步整合入拟南芥基因组中,且T1代转基因植株生长正常。4.原核表达载体构建设计带BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增蜡梅CpEXP2基因,用BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切蜡梅CpEXP2基因和原核表达载体PET-28a,然后将蜡梅CpEXP2基因连接到原核表达载体PET-28a上,经过酶切与PCR验证,表明已经成功构建了含有目的基因的原核表达载体。5.CpEXP2基因在大肠杆菌中的诱导表达将构建好的原核表达载体转入大肠杆菌中,通过合适的诱导条件,诱导CpEXP2基因在E.coliBL21中表达,并通过SDS-PAGE检测重组蛋白证明了CpEXP2基因的表达。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-21
  1.1 Expansin的发现  10-11
  1.2 Expansin的基因家族与分类  11-12
    1.2.1 Expansin的基因家族  11-12
    1.2.2 α-expansin与β-expansin作用的底物差异  12
    1.2.3 α-expansin与β-expansin的序列差异  12
  1.3 Expansin的结构  12-13
  1.4 Expansin的作用机制  13-14
  1.5 Expansin的生化特性  14-15
  1.6 Expansin的组织特异性表达与表达调控  15-16
    1.6.1 扩张蛋白表达的组织特异性  15
    1.6.2 扩张蛋白的表达调控  15-16
  1.7 Expansin的功能  16-21
    1.7.1 促进细胞组织生长  16
    1.7.2 对种子萌发的作用  16-17
    1.7.3 对根系生长的作用  17
    1.7.4 对茎生长的作用  17
    1.7.5 对叶片生长发育的作用  17-18
    1.7.6 对棉纤维发育的作用  18
    1.7.7 对果实成熟软化的作用  18-19
    1.7.8 对花器官的作用  19-20
    1.7.9 对器官脱落的作用  20-21
第二章引言  21-22
第三章 CpEXP2的克隆与分子特性  22-39
  3.1 技术路线  22
  3.2 实验材料  22-23
    3.2.1 蜡梅花cDNA文库  22
    3.2.2 菌株与载体  22
    3.2.3 主要仪器及化学试剂  22-23
    3.2.4 自配主要试剂  23
  3.3 实验方法  23-27
    3.3.1 CpEXP2基因cDNA获得  23-26
    3.3.2 CpEXP2基因cDNA的生物信息学分析  26-27
  3.4 结果与分析  27-37
    3.4.1 蜡梅CpEXP2基因全长cDNA的获得与内含子初步分析  27-28
    3.4.2 CpEXP2基因cDNA序列结构及编码氨基酸序列分析  28-29
    3.4.3 CpEXP2基因编码蛋白的同源分析  29-31
    3.4.4 CpEXP2基因编码蛋白的进化树分析  31
    3.4.5 CpEXP2基因编码蛋白性质与结构分析  31-37
  3.5 讨论  37-39
第四章表达载体的构建与转化拟南芥的研究  39-50
  4.1 技术路线  39
  4.2 实验材料  39-41
    4.2.1 植物材料  39
    4.2.2 菌株与载体  39
    4.2.3 主要仪器及生化试剂  39
    4.2.4 常用溶液配方  39-40
    4.2.5 常用培养基  40-41
  4.3 实验方法  41-45
    4.3.1 CpEXP2基因植物表达载体的构建  41-44
    4.3.2 转化拟南芥及阳性植株的筛选  44-45
  4.4 结果分析  45-49
    4.4.1 CpEXP2基因表达载体的构建  45-47
    4.4.2 根癌农杆菌介导的CpEXP2基因对拟南芥的遗传转化  47-48
    4.4.3 转基因拟南芥的PCR鉴定  48-49
  4.5 讨论  49-50
    4.5.1 pC2301-CpEXP2植物表达载体构建  49
    4.5.2 对拟南芥的遗传转化  49
    4.5.3 花序转染拟南芥的优缺点及改进方法  49
    4.5.4 转化后拟南芥的管理  49-50
第五章原核表达载体的构建与诱导  50-59
  5.1 技术路线  50
  5.2 实验材料  50-52
    5.2.1 菌株与质粒  50
    5.2.2 主要试剂  50-51
    5.2.3 主要设备  51
    5.2.4 常用溶液配方  51
    5.2.5 自配药品  51-52
  5.3 实验方法  52-55
    5.3.1 目的蛋白引物设计  52
    5.3.2 原核表达载体的构建  52-54
    5.3.3 目的蛋白的诱导表达  54
    5.3.4 SDS-PAGE检测表达产物  54-55
  5.4 结果分析  55-58
    5.4.1 CpEXP2基因编码蛋白性质分析  55
    5.4.2 原核表达载体的构建  55-57
    5.4.3 重组质粒pET-28a-CpEXP2在BL21中的诱导表达及检测  57-58
  5.5 讨论  58-59
    5.5.1 扩张蛋白的性质  58
    5.5.2 原核表达菌株的选择  58-59
第六章总结  59-60
  6.1 结论  59
  6.2 下一步研究  59-60
参考文献  60-65
缩略词表  65-66
致谢  66-67
发表论文和参加的研究课题  67

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