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大豆孢囊线虫扩展蛋白基因expansin的克隆和分析及大豆种质资源的抗性鉴定

作　者: 孔祥超
导　师: 李红梅；彭德良
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆孢囊线虫 expansin Southern杂交原位杂交生理小种抗性鉴定
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines, soybean cyst nematode, SCN)是一种土壤传播的植物专性内寄生线虫,其二龄幼虫从根尖侵入大豆根部,造成根组织的代谢失调和组织损伤,从而引起病害。大豆孢囊线虫最早于1899年在中国发现,目前在大豆生产国美国、中国、巴西和日本等地均有发生和为害。大豆孢囊线虫病又称火龙秧子,是目前世界上引起大豆产量损失最严重的病害之一。最初研究认为,expansin是一种体外诱导分离的植物细胞壁伸展蛋白,只存在于植物体内。expansin在控制植物细胞生长方面,能调节细胞壁的膨胀,此外对植物发育也起一定的调控作用,是细胞壁中的一种发育决定成分。Qin等(2004)在对马铃薯金线虫的侵染性二龄幼虫分泌蛋白进行鉴定时,发现其中一种动物源的expansin,与植物具有同源性,在体外实验中能够诱导植物细胞壁的伸展。随后一系列研究证明expansin基因可能在植物寄生线虫中普遍存在,关于大豆孢囊线虫expansin基因的研究尚未见报道。本论文通过反转录PCR (RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了大豆孢囊线虫的expansin基因,并对其序列进行了分析；通过Southern blot确定了其在大豆孢囊线虫基因组中的拷贝数；通过原位杂交确定了其在大豆孢囊线虫中的表达位点。这些研究结果为进一步理解expansin基因的分子致病机制以及研究大豆孢囊线虫的防治策略奠定了理论基础。大豆孢囊线虫群体由于在鉴别寄主上繁殖能力的不同,可以划分为16个生理小种。为了控制大豆孢囊线虫的为害,国内外采用了多种防治方法,包括物理和化学的防治,生物防治以及农业栽培措施等方法,其中最经济有效的方法是选育和培育抗病品种。选育抗病品种的工作首先要筛选大豆品种的抗源,本论文在温室条件下开展了国内外大豆种质资源对黑龙江省SCN 3号生理小种和河北省廊坊的SCN 4号生理小种的抗性鉴定,以期对我国大豆种质资源的抗性水平有初步了解,并为今后的大豆抗病品种选育和抗病品种的利用提供理论依据。1大豆孢囊线虫扩展蛋白基因expansin的克隆和分析从大豆孢囊线虫二龄幼虫中克隆了两个expansin基因Hg-expb1-1 (Genbank登录号HM798586)和Hg-expb1-2 (HQ853293)。Hg-expbl-1 cDNA全长为1 047bp,开放阅读框(ORF)的长度为867bp,推测其编码一个含有288个氨基酸的蛋白质；其基因组DNA全长为2 108bp,含有6个内含子。Hg-expb1-2的cDNA全长为1 037bp,开放阅读框的长度为888bp,推测编码一个含有295个氨基酸的蛋白质,其基因组DNA全长为2 927bp,同样含有6个大小不一的内含子。Southern杂交结果显示Hg-expb1-1在大豆孢囊线虫基因组中以多拷贝或多基因家族的形式存在,原位杂交显示它们均特异地在大豆孢囊线虫亚腹食道腺表达。2大豆种质资源对大豆孢囊线虫3号和4号生理小种的抗性鉴定2009年9月—2010年6月,采用PVC柱法在温室内鉴定了300份大豆种质资源分别对大豆孢囊线虫(SCN)3号和4号生理小种的抗性。用3号生理小种测定得到抗性表现免疫的种质资源12份,表现高抗的28份,表现中抗的39份,分别占测试材料的4.0%、9.3%和13.0%；用4号生理小种测定得到免疫的种质材料8份、高抗的18份和中抗的51份,分别占测试材料的2.7%、6.0%和17.0%。对2个生理小种的毒力差异比较表明,20份大豆种质资源的抗性表现差异明显,4号生理小种的毒力比3号生理小种强。本研究所鉴定出的抗病品种与资源,不仅对农业生产中利用抗病品种合理布局具有指导意义,而且为大豆抗孢囊线虫病的品种培育提供了重要的抗源材料。

全文目录

摘要 6-8ABSTRACT 8-11缩略语 11-12上篇文献综述 12-24 第一章大豆孢囊线虫病概述 13-21 1 大豆孢囊线虫的分类学地位及形态特征 13 2 大豆孢囊线虫的分布和为害 13-14 3 大豆孢囊线虫的寄主范围及生物学特性 14 4 大豆孢囊线虫的生活史 14-15 5 大豆孢囊线虫生理小种的划分 15-17 6 大豆孢囊线虫的致病机理 17-18 7 大豆孢囊线虫防治的研究进展 18-21 7.1 农业技术防治 18 7.2 化学防治 18 7.3 生物防治 18-19 7.4 选用抗耐病品种 19-21 第二章植物寄生线虫expansin的研究进展 21-24 1 expansin简介 21 2 植物寄生线虫expansin的特点 21-23 3 植物寄生线虫与expansin的互作 23-24下篇研究内容 24-71 第一章大豆孢囊线虫扩展蛋白基因expansin的克隆和分析 25-59 1 材料和方法 27-44 1.1 线虫的分离 27 1.2 所用试剂和仪器 27 1.3 线虫基因组DNA的提取(酚-氯仿抽提法) 27-28 1.4 大豆孢囊线虫总RNA的提取 28 1.5 cDNA第一链的合成 28-33 1.6 大豆孢囊线虫Hg-expb1-1基因的克隆 33-38 1.7 大豆孢囊线虫expansin同源基因Hg-expb1-2的克隆 38-40 1.8 大豆孢囊线虫expansin基因的Southern blot 40-42 1.9 大豆孢囊线虫expansin基因的原位杂交 42-44 2 结果 44-56 2.1 大豆孢囊线虫总RNA和基因组DNA的提取 44-45 2.2 大豆孢囊线虫Hg-expb1-1基因的克隆 45-49 2.3 大豆孢囊线虫Hg-expb1-2基因的克隆 49-54 2.4 大豆孢囊线虫expansin基因的Southern blot分析 54-55 2.5 大豆孢囊线虫expansin基因的原位杂交分析 55-56 3 讨论 56-59 第二章大豆种质资源对大豆孢囊线虫3号和4号生理小种的抗性鉴定 59-71 1 材料和方法 60-65 1.1 大豆种质资源 60-64 1.2 抗性鉴定方法 64-65 2 结果与分析 65-68 2.1 大豆种质资源对大豆孢囊线虫3号和4号生理小种的抗性鉴定 65-67 2.2 大豆孢囊线虫3号和4号生理小种对部分大豆种质的毒力比较 67-68 3 讨论 68-71全文结论 71-73参考文献 73-79附录 79-80致谢 80

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