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单端孢菌素诱导人肝癌细胞Hep G2凋亡的作用机制研究

作　者: 崔江涛
导　师: 谭仁祥；杜荣辉
学　校: 南京大学
专　业: 药理学
关键词: 单端孢菌素 Hep G2 凋亡线粒体通路
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

单端孢菌素是由半知真菌类(Fungi Imperfecti)等产毒真菌,在特定条件下所产生的一种具有四环状12,13-环氧骨架结构的毒性代谢产物。它在自然界中污染十分广泛,对人畜健康危害较大。单端孢菌素对机体各组织器官具有广泛的生物效应,作用机制一般认为是抑制蛋白蛋和DNA的合成。近些年的研究表明,单端孢霉烯族真菌毒素可以诱导肿瘤细胞凋亡在细胞凋亡中,线粒体起着中心调控作用,细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关。包括caspase激活因子的释放、电子传递链的改变、膜电位的丧失、细胞内氧化还原状态的改变、Bcl-2家族促进和抑制凋亡蛋白的参与等。本实验首先通过MTT法探索了单端孢菌素对Hep G2细胞活性的影响。通过LDH实验,检测化合物对细胞坏死的作用。DAPI染色观察化合物处理后细胞核形态的变化；DNA ladder实验进一步观察单端孢菌素处理对DNA的损伤作用；然后AV-PI双染流式检测并定量分析了细胞的凋亡率变化。通过形态学,细胞学和分子生物学多重手段验证化合物对细胞的诱导凋亡作用。为进一步探讨了诱导凋亡的机制,我们又利用RT-PCR检测了Bax/Bcl-2和FAS/FASL的表达量变化,并通过Real Time PCR进行确认,以此推断线粒体凋亡通路的激活与否。为了验证ROS的变化,我们采用DCFH-DA荧光探针和ELISA的方法分别检测了胞内和细胞上清中ROS水平；同时我们又考察了化合物对胞内游离的Ca2+浓度的影响以及细胞线粒体膜电位变化。最后,通过Western blotting等手段检测caspase-9和caspase-3的表达及活化情况。结果发现单端孢菌素能有效抑制Hep G2细胞增殖,且成一定的时间剂量依赖关系；且单端孢菌素处理后,细胞上清LDH活性与却对照无明显差异,说明细胞坏死并不明显。DAPI染色荧光拍照发现经单端孢菌素处理24h就可以观察到凋亡形态,核质碎片和皱缩出现；48h后可以看到明显的凋亡小体。DNA-Ladder实验,发现5μg/ml的单端孢菌素处理48h,1.5%凝胶电泳即能观察到明显的180-200bp的凋亡小片段DNA的产生。AV-PI双染细胞,上流式检测发现：10μg/ml的单端孢菌素处理24h凋亡率比对照组升高了37.97%,呈剂量依赖关系；且随时间推移,逐渐从早期凋亡向中晚期凋亡转变。以上实验均证明,单端孢菌素可以诱导Hep G2细胞凋亡。1、5、10μg/ml单端孢菌素处理6h,提取RNA,RT-PCR发现FAS与FASL的表达量均没有明显变化；而Bax相对量分别上升至对照的1.18±0.03；1.22±0.03；1.69±0.05倍, Bcl-2的相对量分别降低为对照的0.85±0.01；0.67±0.06；0.50±0.05倍。胞内ROS水平检测,发现1、5、10μg/ml的单端孢菌素处理Hep G2细胞1 h,即可引起细胞内ROS水平升高；3 h时,ROS水平达到最大,分别为对照的1.38±0.21、1.45±0.13和1.75±0.19倍；之后开始逐渐下降。细胞内游离Ca2+浓度通过荧光探针Fura 2-AM检测发现：1、5、10μg/ml的单端孢菌素处理Hep G2细胞12 h后,升高到对照的1.295±0.02、1.32±0.06和1.43±0.03倍。不同浓度单端孢菌素处理Hep G2细胞6 h,荧光染料Rh123染色,上流式细胞仪检测,发现处理组细胞线粒体膜电位显著降低。Western blotting实验发现单端孢菌素能激活胞浆内活化的caspase-9的高表达；利用caspase-3剪切底物游离发色基团的方法,考察caspase-3的活化程度发现,单端孢菌素1、5、10μg/ml处理24h,胞浆中Caspase-3分别上升至对照的1.46±0.11、1.85±0.24和2.47±0.29倍。由此,可以断定单端孢菌素处理Hep G2细胞后,由于应激反应,短时间内出现ROS水平升高,同时刺激细胞Ca2+内流,使线粒体通透性增加,导致线粒体ΔΨmt下降,释放细胞色素C,激活caspase级联反应,使DNA断裂,产生凋亡小体,导致细胞凋亡出现。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
缩略语表  8-12
第一章文献综述  12-26
  1.1 化学组成与分类  12-13
  1.2 理化性质  13
  1.3 分离鉴定和定量分析  13-15
    1.3.1 产毒菌株  13-14
    1.3.2 提取纯化及结构鉴定  14
    1.3.3 理化检定和定量分析  14-15
  1.4 生物和生理活性研究  15-17
    1.4.1 抑制细胞生长  15
    1.4.2. 免疫抑制活性  15-16
    1.4.3. 对消化系统的影响  16
    1.4.4. 对心脏和血液的影响  16-17
    1.4.5. 对呼吸系统的影响  17
    1.4.6. 对生殖系统的影响  17
    1.4.7. 对大脑的影响  17
    1.4.8. 其它活性  17
  1.5 单端孢霉烯族毒素的致病机理  17-18
  结语  18-19
  参考文献  19-26
绪言  26-27
第一节、单端孢菌素对Hep G2细胞增殖和凋亡的影响  27-44
  1. 材料和方法  27-34
    1.1 实验材料  27-29
      1.1.1 化合物  27
      1.1.2 细胞株  27
      1.1.3 主要试剂  27-28
      1.1.4 主要仪器、器皿  28
      1.1.5 主要溶液配制  28-29
    1.2 实验方法  29-34
      1.2.1 细胞培养  29
      1.2.2 MTT法细胞活性试验  29-30
      1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH)活性测定  30
      1.2.4 细胞凋亡的形态学检测  30-31
      1.2.5 Annixin V-PI双染检测细胞凋亡  31-32
      1.2.6 DNA Ladder分析  32-33
      1.2.7 统计分析  33-34
  2. 实验结果  34-40
    2.1 单端孢菌素对Hep G2细胞活性影响  34-35
    2.2 单端孢菌素对Hep G2上清LDH活性影响  35-37
    2.3 DAPI荧光染色检测单端孢菌素对Hep G2的凋亡影响  37-38
    2.4 Annexin V/PI双染流式细胞术对细胞凋亡定量分析  38-40
    2.5 DNA Ladder分析  40
  3. 讨论  40-43
  小结  43-44
第二节单端孢菌素诱导Hep G2凋亡的机制研究  44-74
  1. 材料和方法  44-58
    1.1 实验材料  44-46
      1.1.1 化合物  44
      1.1.2 细胞株  44
      1.1.3 主要试剂  44-45
      1.1.4 主要仪器、器皿  45-46
    1.2 实验方法  46-58
      1.2.1 RT-PCR检测Bax/Bcl-2和FAS/FASL的变化  46-48
      1.2.2 Realtime PCR检测Bax/Bcl-2表达量的变化  48-50
      1.2.3 活性氧(ROS)检测  50-51
      1.2.4 胞内钙离子浓度([Ca~(2+)]_i)检测  51-52
      1.2.5 线粒体膜电位(△ψmt)检测  52
      1.2.6 Western blotting检测Caspase-9的表达  52-56
      1.2.7 Capase-3活性检测  56-57
      1.2.8 统计分析  57-58
  2. 实验结果  58-67
    2.1 RT-PCR检测Bax/Bcl-2和FAS/FASL的表达量变化  58-60
    2.2 Real Time PCR检测Bax/Bcl-2表达量变化  60-61
    2.3 单端孢菌素对Hep G2细胞ROS的影响  61-63
    2.4 单端孢菌素对Hep G2细胞内钙离子浓度的影响  63-64
    2.5 单端孢菌素对Hep G2细胞线粒体膜电位(△ψmt)的影响  64-65
    2.6 Western blotting来检测凋亡蛋白caspase-9的表达情况  65-66
    2.7 Caspase-3活性变化检测  66-67
  3. 讨论  67-73
  小结  73-74
结语  74-75
参考文献  75-83
硕士阶段发表论文情况  83-84
致谢  84-85

单端孢菌素诱导人肝癌细胞Hep G2凋亡的作用机制研究

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