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依硫磷酸抑制白血病细胞生物学活性、保护骨髓基质细胞及对化疗药物抗白血病作用影响的实验研究

作　者: 刘璇
导　师: 潘崚；朱宏丽
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 白血病 骨髓基质细胞 依硫磷酸 细胞增殖 凋亡 细胞周期 化疗 长春新碱 阿糖胞苷 流式细胞术 实时定量PCR
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:白血病(leukemia)是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,我国白血病的发病率约为2.76/10万/年,在所有恶性肿瘤死亡率中,白血病居第6位,而在儿童及35岁以下成人居第1位。近年来白血病的治疗不断优化,除传统化疗、造血干细胞移植外,以急性早幼粒细胞白血病诱导分化治疗为代表的靶向治疗以及免疫细胞治疗已取得很大进步。白血病治疗中化疗耐药以及化疗药物和白血病细胞抑制骨髓增生仍是迫切需要解决的临床难题,是影响疗效和预后的关键因素。依硫磷酸的中文通用名为氨磷汀,英文名称Ethiofos、Amifostine、WR-2721或Ethyol,是第一个被国际权威机构认可的广谱细胞保护剂,最先由美军陆军研究所开发出来,用作核辐射和化学武器损伤的防护。1996年美国FDA批准依硫磷酸上市,用于预防化疗不良反应,起到保护骨髓、肾脏及心脏等器官的作用。通常认为,依硫磷酸发挥细胞保护作用的经典药理机制为碱性磷酸酯酶途径。近年来,研究发现依硫磷酸具有多方面的生物学作用,主要有类造血细胞生长因子作用以及诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞周期和抗血管生成等抗肿瘤作用,而这些作用的机制无法用经典的碱性磷酸酶途径来解释。目前,有关依硫磷酸对白血病细胞及骨髓基质细胞的生物学活性影响是否存在差异尚不明确,在临床白血病化疗中应用依硫磷酸保护正常骨髓的同时是否会保护白血病细胞以及对化疗疗效的影响还不清楚。本实验以人急性巨核细胞白血病细胞株Dami、急性早幼粒白血病细胞细胞株HL-60及非恶性血液病患者的原代骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell, BMSC)为对象,研究了依硫磷酸对白血病细胞和骨髓基质细胞增殖、周期、凋亡的影响,以及对具有不同作用机理的化疗药物如阿糖胞苷和长春新碱抗白血病作用的影响,并检测了Dami相关基因表达变化,初步探讨了依硫磷酸抑制肿瘤细胞增殖作用的分子机制。方法:采用CCK-8法检测依硫磷酸对Dami、HL-60及BMSC增殖的影响;倒置显微镜观查细胞的形态学改变;DNA琼脂糖凝胶电泳观测凋亡的梯形条带,AnnexinV/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡情况;PI染色流式细胞术检测细胞周期及倍体变化;荧光实时定量PCR法检测细胞凋亡相关基因bcl-2、caspase-3、细胞周期相关基因cyclinA、cyclinB1、cyclinD1和巨核细胞分化相关基因GATA-1、NF-E2 mRNA表达水平的变化。结果:1依硫磷酸对Dami、HL-60的增殖具有抑制作用,终浓度为0.35mg/ml、0.75mg/ml、1.5mg/ml的依硫磷酸作用24h、48h、72h,抑制率呈浓度和时间依赖性增加,作用48h对Dami、HL-60的抑制率分别为56.42%、89.72%、92.08%和43.86%、80.47%、86.5%,作用48h的半数抑制浓度分别为0.25mg/ml和0.37mg/ml。但相同浓度范围的依硫磷酸作用48h对BMSC增殖无影响。2终浓度为0.35mg/ml、0.75mg/ml和1.5mg/ml的依硫磷酸作用Dami、HL-60细胞24h、48h,细胞凋亡增加。不同终浓度依硫磷酸处理Dami细胞24h后总凋亡率分别为9.123±3.766%、11.320±1.530%、11.890±3.200%、17.543±3.365%; 48h后总凋亡率分别为6.727±3.126%、20.203±5.115%、30.023±6.433%、63.397±24.064%,且呈浓度和时间依赖性。相同浓度的依硫磷酸作用于HL-60细胞趋势相同。相同浓度范围的依硫磷酸作用于BMSC 24h、48h,细胞凋亡无改变。3终浓度0.35mg/ml、0.75mg/ml和1.5mg/ml的依硫磷酸作用Dami细胞24h、48h。24小时后,未处理组G0/G1期细胞比例平均为46.28%,处理组平均为14.19%,未处理组G2/M期细胞比例平均为13.39%,0.35mg/ml依硫磷酸处理组平均为68.20%。48小时后,未处理组G0/G1期细胞比例平均为43.57%,处理组平均为4.27%;未处理组G2/M期细胞比例平均为15.65%,处理组G2/M期细胞比例平均为67.82%。G0/G1期、S期细胞减少,G2/M期细胞增多。4低浓度依硫磷酸(0.35mg/ml)对阿糖胞苷抑制Dami、HL-60增殖作用无影响,可增强长春新碱对两株细胞增殖的抑制作用。依硫磷酸对阿糖胞苷抑制BMSC的作用无影响,但可减轻长春新碱对BMSC的抑制作用。5低浓度依硫磷酸(0.35mg/ml)对阿糖胞苷和长春新碱促进Dami、HL-60凋亡作用无影响。6依硫磷酸作用Dami细胞后24h,0.75mg/ml和1.5mg/ml组bcl-2 mRNA表达减低为对照组的0.307和0.532倍(p<0.05); 1.5mg/ml组caspase-3 mRNA表达增加,为对照组的5.047倍(P<0.05); 0.35mg/ml和0.75mg/ml组cyclinD1 mRNA表达增加,分别为对照组的2.78和1.856倍(p<0.05);其余各浓度组以及cyclinB1、GATA-1和NF-E2 mRNA表达无变化。结论:依硫磷酸具有抑制白血病细胞系Dami、HL-60增殖和促进其凋亡的作用,可增强长春新碱抗白血病作用,且这种作用可能是通过调控细胞周期阻滞于G2/M、下调抗凋亡基因bcl-2和上调凋亡基因caspase-3机制而实现。依硫磷酸对BMSC增殖和凋亡无影响,但可减轻长春新碱对BMSC的抑制作用。

全文目录


中文摘要  4-7
英文摘要  7-12
前言  12-13
材料与方法  13-20
结果  20-24
附图  24-30
附表  30-35
讨论  35-41
结论  41
参考文献  41-45
综述 免疫性血小板减少症的免疫病理机制研究进展  45-59
  参考文献  53-59
致谢  59-60
个人简历  60

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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