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副溶血性弧菌FlaE蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

作　者: 彭慧峰
导　师: 徐明芳；张菊梅
学　校: 暨南大学
专　业: 生物工程
关键词: 副溶血性弧菌 flaE基因 原核表达 亲和纯化
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)是存在于近岸海洋环境的嗜盐细菌,它常常因为污染海味食品而引起人类急性胃肠炎,也可引起反应性关节炎,是一种重要的食源性致病菌。副溶血性弧菌具有极性鞭毛和周身鞭毛两个鞭毛系统以适应不同环境,其鞭毛蛋白有良好的免疫原性,可作为抗原制备抗体。本实验通过构建原核表达极性鞭毛FlaE蛋白的重组大肠杆菌,经IPTG诱导表达并通过亲和层析纯化获得目的蛋白,以其作为抗原制备多克隆抗体,为制备免疫磁珠,建立VP的快速富集和检测奠定基础。本实验主要得研究内容和结果如下：经Genebank中查得Vibrio parahaemolyticus,BB22菌株极性鞭毛基因FlaE基因序列(登录号为U12817.2),设计引物,利用PCR方法采用高保真酶从标准株ATCC17802基因组中扩增出flaE基因片段,回收所得的扩增产物与pMD 19-Tvector连接,转化大肠杆菌DH5a,利用氨苄青霉素、蓝白斑筛选和菌落PCR初步确认阳性重组子,随后进行测序鉴定。测序结果表明目的基因全长1122bp,与Genebank上VP. BB22 flaE基因片段同源性达98%。双酶切pMD 19-T重组子,再与经相同双酶切处理的表达载体pET22b(+)连接,得到重组表达载体pET22b-flaE,转化大肠杆菌BL21(DE3)。0.8 mM IPTG,37℃,3h诱导重组蛋白表达。经SDS-PAGE分析表明蛋白分子量约为40kDa(与DNASTAR计算结果一致),以包涵体形式表达。对目的蛋白的多聚组氨酸标签进行亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析纯化结果,同时利用BCA法测定融合蛋白含量。纯化蛋白经佐剂乳化制备抗原,免疫新西兰兔子,收获抗血清,用ELISA方法测得抗体效价为1：204800.

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
缩写词表  9-11
第一章 绪论  11-18
  1. 副溶血性弧菌简介  11-16
    1.1 副溶血性弧菌的危害  11
    1.2 副溶血性弧菌的鞭毛系统  11-14
      1.2.1 鞭毛系统的基因组  11-13
      1.2.2 极性鞭毛的结构和组装  13-14
      1.2.3 副溶血性弧菌鞭毛的功能  14
    1.3. 副溶血性弧菌的检测方法  14-16
      1.3.1 传统检测方法  14-15
      1.3.2 PCR检测法  15
      1.3.3 基因芯片  15
      1.3.4 免疫分析检测  15-16
  2. 本实验的目的和意义  16-18
第二章.副溶血性弧菌flaE基因的克隆及表达载体的构建  18-31
  1 材料与方法  18-23
    1.1 材料  18-19
      1.1.1 菌株与质粒  18
      1.1.2 主要实验材料  18
      1.1.3 主要试剂和培养基  18-19
    1.2 方法  19-23
      1.2.1 引物设计与合成  19
      1.2.2 PCR扩增  19
      1.2.3 琼脂糖凝胶电泳  19
      1.2.4 PCR产物的回收与纯化  19-20
      1.2.5 目的片段和克隆载体的连接  20
      1.2.6 连接产物转化大肠杆菌DH5a  20-21
      1.2.7 克隆重组子的鉴定  21-22
      1.2.8 表达系统的构建  22-23
  2 结果与分析  23-30
    2.1 副溶血性弧菌flaE基因的PCR扩增  23-25
    2.2 克隆载体的构建及鉴定  25-27
    2.3 目的片段的序列分析  27-29
    2.4 表达载体的构建  29-30
  4. 本章小结  30-31
第三章 副溶血性弧菌flaE基因的原核表达、蛋白纯化及其多克隆抗体的制备  31-44
  1. 材料与方法  31-37
    1.1 材料  31-32
      1.1.1 菌株与质粒  31
      1.1.2 主要实验材料  31
      1.1.3 主要实验试剂  31-32
      1.1.4 主要设备  32
    1.2 方法  32-37
      1.2.1 蛋白的诱导表达  32-33
      1.2.2 融合蛋白的纯化  33-34
      1.2.3 纯化蛋白的含量测定  34-35
      1.2.4 FlaE蛋白多克隆抗血清制备  35-36
      1.2.5 ELISA检测  36-37
  2 结果与分析  37-43
    2.1 大肠杆菌BL21(DE3)中融合蛋白的表达  37-38
    2.2 融合蛋白的表达形式  38
    2.3 融合蛋白的纯化  38-39
    2.4 纯化蛋白的定量  39-40
    2.5 多克隆抗血清制备及效价测定  40-43
  4. 本章小结  43-44
结果与展望  44-46
  1. 本实验的主要结论  44
  2. 本研究主要创新点  44-45
  3. 展望  45-46
参考文献  46-50
致谢  50

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
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