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蜡梅蛋白酶抑制剂基因CpKTI功能初步分析

作　者: 曹鑫
导　师: 眭顺照；李名扬
学　校: 西南大学
专　业: 花卉学
关键词: 蜡梅蛋白酶抑制剂基因原核表达转基因烟草基因工程
分类号: S685.99
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

蜡梅(Chimonanthus praecox (L.) Link)是蜡梅科(Calycanthaceae)蜡梅属(Chimonanthus Lindl.)植物,为原产我国的落叶丛生灌木,花期11月到翌年3月,具有良好的抗寒特性,并且病虫害发生极少。试验从蜡梅中克隆并分析蛋白酶抑制剂基因,了解蜡梅蛋白酶抑制剂基因在蜡梅抗虫中的所起的作用,并且主要从基因的分子特性及其基因表达方面进行了研究。取得的主要结果如下：1.蜡梅蛋白酶抑制剂基因的分子特征在构建蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,通过随机克隆测序,克隆了1个蜡梅蛋白酶抑制剂的cDNA基因,经BLAST蛋白分析,其属于Kunitz trypsin inhibitor超级家族,命名为CpKTI。其编码蛋白与欧洲山杨、大豆等氨基酸序列相似性达90%。进一步序列比较分析表明,CpKTI是从蜡梅中克隆得到的1个蛋白酶抑制剂基因。CpKTI的cDNA基因全长979bp,其中含有594bp的开放阅读框,编码一个由197个氨基酸残基组成的蛋白酶抑制剂基因,不含有内含子。其编码区的G+C含量为47.47%,理论分子量约为21.72kD,预测等电点为4.87。运用生物信息学的手段对CpKTI编码的蛋白的结构特点与性质进行了分析,蜡梅CpKTI基因编码的蛋白推测的二级结构主要由α螺旋(Alpha helix,14.72%)、延伸链(Extended strand,35.03%)、随机卷曲(Random coil,43.65%)三部分组成；该基因编码的蛋白含有长约24aa的信号肽序列,并且有一个明显的信号肽剪切的位点：疏水性区域占主导,总体表现为疏水性,有利于蛋白质的结构定位在膜上；CpKTI蛋白主要存在三种磷酸化氨基酸,含有6个磷酸化位点,推测翻译后的蛋白可以进行较多样化的修饰,这可能与蛋白酶抑制剂多抗性的特性有关,另外,蜡梅CpKTI基因编码的蛋白具有两个跨膜结构,其具体的作用还有待于深入研究。2.蜡梅CpKTI基因植物表达载体构建及转基因烟草抗虫性初探以限制性内切酶XBa I和Sac I分别双酶切CpKTI的加酶切位点的PCR产物和pCAMBIA2301载体,分别回收CpKTI片段和pCAMBIA2301载体,连接,获得重组表达载体质粒,用冻融法转化入农杆菌LBA4404。用叶盘法转化烟草W38,获得具Km抗性的烟草植株30个单株系,通过PCR、RT-PCR检测,最终获得14个转基因烟草单株系。调查饲喂菜粉蝶的危害情况,转蜡梅CpKTI基因烟草与非转基因烟草都未受到菜粉蝶的取食危害。3. CpKTI基因原核表达载体的构建与诱导表达采用PCR将目的基因克隆出来,与PMD19-T载体相连,经测序检测正确后,将含有CpKTI基因的PMD19-T载体和PET-32a(+)用BamHI和HindIII双酶切,分别回收基因片段和表达载体并连接。对重组质粒进行PCR检测和酶切鉴定,说明了含有CpKTI基因的原核表达载体构建成功。通过切除信号肽序列并将蜡梅蛋白酶抑制剂基因构建到原核表达载体pET-32a(+)中,转化宿主大肠杆菌BL21诱导表达,获得了重组蛋白。用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导蛋白的表达,经SDS-PAGE检测重组蛋白说明了CpKTI在E.coli中得到了表达。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
1 文献综述  10-20
  1.1 蜡梅(Chimonanthus praecox(L.) Link)简介  10
  1.2 蛋白酶抑制剂的分布及分类  10-11
  1.3 蛋白酶抑制剂的作用机理  11
  1.4 蛋白酶抑制剂的应用进展  11-13
    1.4.1 蛋白酶抑制剂抗虫基因工程应用进展  11-12
    1.4.2 在大肠杆菌中表达的产物的应用  12
    1.4.3 在临床医学方面  12-13
    1.4.4 作为饲料方面  13
    1.4.5 其他作用  13
  1.5 蛋白酶抑制剂的表达调控  13-20
    1.5.1 植物蛋白酶抑制剂抗虫转基因工程表达调控存在的问题  13-15
    1.5.2 植物蛋白酶抑制剂抗虫转基因工程表达调控的对策分析  15-20
2 引言  20-24
  2.1 研究背景及意义  20-22
  2.2 技术路线  22-24
3 蜡梅CpKTI的克隆与分子特性  24-38
  3.1 技术路线  24
  3.2 实验材料  24-26
    3.2.1 蜡梅花cDNA文库  24
    3.2.2 菌株与载体  24
    3.2.3 主要生化试剂及仪器设备  24-25
    3.2.4 试验常用溶剂配方  25
    3.2.5 基本培养基配方  25-26
  3.3 实验方法  26-29
    3.3.1 EST序列特征分析  26
    3.3.2 蜡梅CpKTI基因的cDNA获得  26-29
    3.3.3 CpKTI基因cDNA生物信息学分析  29
  3.4 结果与分析  29-37
    3.4.1 蜡梅CpKTI基因全长的获得与cDNA序列结构特征  29-30
    3.4.2 CpKTI基因编码蛋白信息学分析  30-37
  3.5 讨论  37-38
4 植物表达载体构建与转基因烟草的获得和分析  38-52
  4.1 技术路线  38
  4.2 实验材料  38-40
    4.2.1 植物材料  38
    4.2.2 菌株和载体  38
    4.2.3 主要生化试剂  38
    4.2.4 试验常用溶剂配方  38-39
    4.2.5 基本培养基配方  39-40
  4.3 实验方法  40-45
    4.3.1 CpKTI基因植物表达载体构建  40-42
    4.3.2 基因导入烟草及转化植株的获得  42-43
    4.3.3 转基因烟草移栽  43
    4.3.4 转基因烟草的检测  43-44
    4.3.5 蜡梅CpKTI基因烟草的抗虫试验  44-45
  4.4 结果与分析  45-51
    4.4.1 表达载体的构建  45-46
    4.4.2 蜡梅CpKTI基因导入烟草及转化植株的获得  46-50
    4.4.3 蜡梅CpKTI基因抗虫性检测  50-51
  4.5 讨论  51-52
    4.5.1 pCAMBIA2301-CpKTI植物表达载体构建与转基因植物的获得  51
    4.5.2 转基因烟草抗虫性分析  51-52
5 原核表达载体的构建与蛋白诱导  52-60
  5.1 技术路线  52
  5.2 实验材料  52-54
    5.2.1 菌株与载体  52
    5.2.2 主要试剂  52
    5.2.3 主要设备  52-53
    5.2.4 自配试剂  53-54
  5.3 实验方法  54-57
    5.3.1 目的蛋白引物设计  54-55
    5.3.2 原核表达载体构建  55-56
    5.3.3 诱导重组载体的融合蛋白表达  56-57
    5.3.4 SDS-PAGE检测表达产物  57
  5.4 结果与分析  57-59
    5.4.1 原核表达载体的构建  57-58
    5.4.2 重组质粒PET-32a(+)-CpKTI在BL21中的诱导表达和检测  58-59
  5.5 讨论  59-60
6 下一步研究计划  60-62
参考文献  62-68
缩略词表  68-70
致谢  70-72
在学期间发表的文章和参加的课题  72

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