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一种新的草甘膦降解基因的克隆及其产物功能分析

作　者: 代春妍
导　师: 郝东云
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 宏基因组文库草甘膦降解酶甘氨酸氧化酶克隆异源表达与纯化酶性质分析
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

草甘膦是一种具有广谱灭生性,内吸传导性的优良除草剂。它的作用机理是竞争性的抑制生物体内莽草酸合成途径的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,简称EPSPs)的活性。莽草酸合成途径是植物和部分微生物体内芳香族氨基酸合成的重要途径,EPSPs是这个过程的一个关键酶。由于草甘膦对该酶的抑制作用,使得蛋白质合成所必须的芳香族氨基酸和相关次生代谢产物的合成受阻,从而干扰了生物体正常的氮代谢而死亡。虽然草甘膦具有广谱、高效等众多优点,但这类除草剂在杀死杂草的同时,对农作物有着同样的灭生作用,这就限制了它的适用范围。因此,如何克服草甘膦对作物的负作用受到了广泛的关注,对草甘膦的相关研究也成为了国内外研究的热点。为了充分利用草甘膦的除草优势,扩大它的使用范围,培育草甘膦抗性转基因作物被认为是最有应用前景的一种杂草防治对策。目前,商业化种植的草甘膦抗性转基因作物均为针对EPSPs所设计,但这种机制不能将草甘膦降解。草甘膦经植物体吸收后可能在分生组织中积累,影响植物的生长发育进而降低作物产量。本研究发现了一种新的草甘膦降解酶基因——甘氨酸氧化酶基因,该基因编码产物可以将草甘膦降解成无毒的化合物,避免了草甘膦在植物体内的残留,为草甘膦在植物上的应用提供了一种可选择的全新途径。本研究利用草甘膦污染土壤微生物总DNA构建宏基因组文库,采用活性筛选方法从110000个含有插入片段的阳性克隆中发现了一个具有草甘膦抗性的克隆,命名为Glp-1。测序结果表明其上含有一个甘氨酸氧化酶(glycine oxidase,简称GO)编码基因,命名为goA。该基因序列长为1110bp,编码一个由369aa组成的蛋白质,理论分子量为40686.5Da。蛋白质同源性分析发现该ORF编码产物与源自Bacillus subtilis strain 168的GO仅有着88%同源性。将goA构建到表达载体pEASY-E1上,在E. coli BL21(DE3) pLysS中过表达。采用Ni亲和层析和阴离子交换层析对GOA进行纯化,纯化后GOA的比活力为0.283U/mg,目的蛋白得率为88.9%。酶活测定表明,GOA能将草甘膦降解为无毒的化合物氨甲酰磷酸和乙醛酸。GOA对底物草甘膦、亚氨基二乙酸、甘氨酸和N-乙基甘氨酸等都表现出较高的催化活性。酶的最适温度为50℃,在50℃以下保温30min后仍保留85%以上的活性。酶的最适pH为8.5,在较宽的pH范围(pH7.3-10.3)保持着大于85%的催化活性。GOA对草甘膦的亲和性(1/Km)是Pedotti等报道的野生型GO的8倍,对草甘膦的底物选择性(对草甘膦的kcat/Km与其对甘氨酸的kcat/Km之比)是后者的5.5倍。分子动力学计算表明,GOA与草甘膦的结合自由能为-4.48 kcal/mol是GO (-1.90 kcal/mol)的2.36倍。从模拟的GOA/GO与草甘膦复合物三维结构中发现,GOA与草甘膦复合物多了2个H键且H键距离更短。目前,我国在草甘膦抗性研究方面还处于起步阶段,具有应用价值的草甘膦降解基因还很匮乏。因此,有必要挖掘新的具有自主知识产权的草甘膦降解基因,为具有草甘膦抗性或降解农作物的研发提供潜在的具有应用价值的基因资源。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-11
第一章绪论  11-26
  1.1 除草剂概述  11-13
    1.1.1 除草剂的分类  12
    1.1.2 除草剂的作用机制  12
    1.1.3 抗除草转基因作物的提出与发展  12-13
  1.2 草甘膦生物抗性研究  13-21
    1.2.1 草甘膦简介  14-16
    1.2.2 草甘膦生物抗性获得途径  16-17
    1.2.3 草甘膦代谢基因研究进展  17-21
  1.3 宏基因组学概述  21-25
    1.3.1 宏基因组学研究策略  22-24
    1.3.2 宏基因组学发掘新基因方面的应用  24-25
  1.4 本研究的目的和意义  25-26
第二章材料和方法  26-49
  2.1 实验材料  26-36
    2.1.1 土壤样品来源  26
    2.1.2 菌种与质粒  26-27
    2.1.3 本研究所用到的引物  27
    2.1.4 主要试剂  27-29
    2.1.5 主要仪器  29-31
    2.1.6 培养基  31
    2.1.7 常用溶液  31-36
  2.2 实验方法  36-49
    2.2.1 土壤总DNA的分离  36-37
    2.2.2 土壤总DNA的纯化  37-38
    2.2.3 宏基因组文库构建  38-39
    2.2.4 pEASY-E1表达载体构建方法  39
    2.2.5 EZ-Tn5转座子插入突变方法  39-40
    2.2.6 插入片段的生物信息学分析  40
    2.2.7 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收步骤  40-41
    2.2.8 SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化步骤  41
    2.2.9 SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒纯化步骤  41-42
    2.2.10 菌落PCR筛选阳性克隆  42
    2.2.11 PCR扩增goA基因  42-43
    2.2.12 目的基因的表达与纯化  43-44
    2.2.13 BioLogic Duoflow蛋白纯化系统操作流程  44
    2.2.14 Bradford蛋白质定量试剂盒操作步骤  44-45
    2.2.15 SDS-PAGE凝胶电泳  45
    2.2.16 Western-blot实验方法  45-47
    2.2.17 甘氨酸氧化活性测定方法  47-48
    2.2.18 甘氨酸氧化酶动力学测定方法  48
    2.2.19 甘氨酸氧化酶分子动力学分析  48-49
第三章结果与讨论  49-69
  3.1 引言  49
  3.2 实验结果  49-69
    3.2.1 土壤总DNA的提取  49-50
    3.2.2 土壤总DNA的纯化  50-51
    3.2.3 宏基因组文库的构建  51-52
    3.2.4 基因组文库的评价  52
    3.2.5 文库的筛选  52-53
    3.2.6 阳性克隆质粒pGlp-1插入序列分析  53-54
    3.2.7 质粒pGlp-1插入片段的序列分析  54-56
    3.2.8 goA序列的扩增与表达载体构建  56-57
    3.2.9 GOA异源表达  57-60
    3.2.10 GOA底物特异性  60-61
    3.2.11 最适温度  61
    3.2.12 GOA温度稳定性  61-62
    3.2.13 最适pH  62-63
    3.2.14 GOA pH稳定性  63-64
    3.2.15 酶动力学分析  64-65
    3.2.16 GOA分子动力学研究  65-69
第四章结论  69-70
参考文献  70-76
附录  76-77
作者简介及在学期间所取得的科研成果  77-78
致谢  78

一种新的草甘膦降解基因的克隆及其产物功能分析

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