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酯酶EstB表达纯化及酶学性质分析

作　者: 张晓英
导　师: 焦明大；郝东云
学　校: 东北师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 脂类水解酶酯酶宏基因组文库原核表达及纯化酶学性质分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

微生物是目前最大的天然资源库。环境中有99%的微生物都是不可或者难以培养的,所以只有不到1%的微生物能够被人类认识并利用。20世纪末发展起来的宏基因组学是利用分子生物学技术绕过培养分离的方法来对微生物的多样性及其功能性进行研究的新兴科学。目前已经通过此技术筛选得到了大量新的功能基因,例如编码脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、水解酶、氧化还原酶等活性物质的基因。本文采用宏基因组文库的方法对土壤中编码脂类水解酶的基因进行筛选,利用功能筛选法即向平板中加入三丁酸甘油酯(Tributyrin)作为筛选底物获得了一个阳性克隆。该阳性克隆经过测序得知:此基因包含全编码区为1185 bp,编码394个氨基酸序列,理论分子量为40900 Da。Blastp分析表明该蛋白与Ralstonia pickettii 12J编码的酯酶(Genbank检索号:NC-010682.1)同源性最高为38%,且都具有GDSL水解酶超家族保守结构域。说明它可能是GDSL酯/脂肪酶家族重要成员之一。通过使用在线软件预测,该基因编码的蛋白可能含有信号肽。为防止信号肽影响可溶性蛋白的顺利表达,分别设计了含有信号肽和不含有信号肽的两种引物,扩增后的序列分别构建到原核表达载体中,经诱导培养后,可以明显看到不含信号肽的克隆有大量的蛋白表达。将克隆菌株进行超声破碎后,分别将裂解后的上清和沉淀进行SDS-聚丙烯酰胺凝聚电泳,从电泳结果得知:目的蛋白多数都以聚集体的形式出现在沉淀中。为了提高目的蛋白的溶解度,向裂解液中加入0.5%的脱氧胆酸钠可以获得大量的可溶性蛋白。对不含有信号肽的可溶性蛋白粗提液进行Ni-NTA亲和层析纯化和离子交换除盐处理获得纯酶液。对纯化的酶液进行酶学性质分析可知:该酶能水解对硝基苯乙酸(pNPC2),对硝基苯丁酸(pNPC4),对硝基苯辛酸(pNPC8),对硝基苯癸酸(pNPC10),对硝基苯月桂酸(pNPC12)等多种对硝基苯酯,且底物为pNPC10时水解活性最大,所以推测该蛋白是水解短链脂肪酸的酯酶。进一步测定此酶的最适温度和最适pH,发现其发挥最大酶活的pH为10.0,最适温度为47.5℃,属于中温耐碱性酯酶。通过向反应体系中加入不同的离子和去污剂,比较加入离子和去污剂前后酶活的变化可以得出结论:Cu2+、Mn2+、Mg2+、DOC(1%)、Tween-20(0.1%)都能够促进酶活;而Co2+、SDS(1%)、Triton X-100(1%)、Tween-20(1%)、Tween-80(0.1%)、Tween-80(1%)都对酶活性有一定的抑制作用;Ca2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和SDS(0.1%)对酶活性影响不大。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-10
引言  10-16
  1. 脂肪酶  10-13
    1.1 脂肪酶简介  10
    1.2 脂肪酶的结构特征与酶学特性  10-11
    1.3 极端环境下的脂肪酶  11
    1.4 碱性脂肪酶  11-12
    1.5 酯酶与脂肪酶的关系  12
    1.6 脂肪酶的应用及展望  12-13
  2. 利用宏基因组学技术筛选新型脂肪酶  13-16
    2.1 宏基因组技术起源  13
    2.2 宏基因组研究现状概述  13
    2.3 基于宏基因组学的脂肪酶筛选  13-14
    2.4 宏基因组应用前景  14-16
第一章实验材料  16-20
  1.1 阳性克隆的来源  16
  1.2 菌株与质粒  16
  1.3 主要试剂  16-17
    1.3.1 抗生素  16
    1.3.2 试剂  16-17
    1.3.3 试剂盒  17
    1.3.4 工具酶与Marker  17
  1.4 主要仪器  17-18
  1.5 培养基  18
  1.6 常用溶液  18-20
第二章实验流程及方法  20-29
  2.1 实验流程  20
  2.2 实验方法  20-23
    2.2.1 阳性克隆的获得  20
    2.2.2 阳性克隆的酶切鉴定  20-21
    2.2.3 克隆酯酶estB 基因  21-22
    2.2.4 酯酶基因目的片段的生物信息学分析  22
    2.2.5 克隆载体pET28a 的线性化  22
    2.2.6 重组表达载体的构建  22-23
    2.2.7 重组表达载体的鉴定  23
    2.2.8 高效表达菌株的构建  23
    2.2.9 重组表达蛋白菌株诱导条件的摸索  23
  2.3 分子生物学常规实验方法  23-26
    2.3.1 碱变性法提取质粒DNA  23-24
    2.3.2 大肠杆菌CaCl_2感受态细胞的制备  24
    2.3.3 大肠杆菌CaCl_2感受态细胞的转化方法  24
    2.3.4 重组菌株蛋白的诱导表达步骤  24-25
    2.3.5 镍柱纯化可溶性蛋白步骤  25
    2.3.6 聚集体蛋白的变性及纯化  25
    2.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳配制  25-26
    2.3.8 蛋白电泳样品处理及电泳  26
  2.4 酶学性质初步表征  26-29
    2.4.1 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度  26-27
    2.4.2 酯酶活力的测定  27
    2.4.3 酶底物特异性的测定  27
    2.4.4 最适温度的测定  27
    2.4.5 温度对酶活力稳定性的影响  27
    2.4.6 最适pH 的测定  27-28
    2.4.7 金属离子和去污剂的影响  28-29
第三章实验结果  29-43
  3.1 阳性克隆酶切验证结果  29
  3.2 克隆酯酶 estB 基因 PCR 结果  29-30
  3.3 插入片段的生物信息学分析结果  30-35
    3.3.1 estB 基因编码的酯酶水解酶理化性质分析  30-31
    3.3.2 二级结构预测  31
    3.3.3 亲水性疏水性分析  31-32
    3.3.4 信号肽和结构域预测  32-34
    3.3.5 三维结构可能性预测（271-390）  34
    3.3.6 同源性分析  34-35
  3.4 表达载体的鉴定结果  35-36
  3.5 重组蛋白表达纯化电泳图谱  36-39
    3.5.1 信号肽对诱导前后表达量的影响  36-37
    3.5.2 对不含信号肽表达菌株的上清液进行纯化图谱  37-38
    3.5.3 对不含有信号肽的表达菌株沉淀进行破碎后纯化图谱  38
    3.5.4 沉淀中纯化蛋白考马斯亮蓝染色与活性染色对比图谱  38-39
  3.6 酶学性质初步表征结果  39-43
    3.6.1 底物特异性  39-40
    3.6.2 酶最适温度的测定  40
    3.6.3 温度对酶活力稳定性的影响  40-41
    3.6.4 pH 对酶活力的影响  41
    3.6.5 不同离子和去污剂对酶活力的影响  41-43
结论  43-44
讨论  44-45
参考文献  45-48
致谢  48

酯酶EstB表达纯化及酶学性质分析

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