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猪CuZnSOD基因的克隆、mRNA表达及其对肉质抗氧化性能的影响

作　者: 杜金芳
导　师: 曾勇庆
学　校: 山东农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪 CuZnSOD 基因克隆表达分析 QRT-PCR 抗氧化肉质特性
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

随着现代饲养业集约化程度的不断提高,氧化在商品猪生产中的危害已大量显现,可负面影响活体动物的免疫机能和宰后肉质特性等。抗氧化酶可缓解或者抑制自由基的负面效应,提高商品猪的抗氧化能力,进而改善商品猪的肉质。CuZnSOD(Copper Zinc Superoxide Dismutase)是超氧化物歧化酶(SODs)家族的成员之一,是集体防御氧化损伤的一种重要的金属酶,能转移性地清除超氧阴离子自由基,在维持氧自由基平衡方面起着重要的作用。为了进一步了解和认识CuZnSOD基因的结构和功能,揭示CuZnSOD对猪抗氧化机能的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记。本研究采用RACE(Rapid Amplification of cDNA End)和Genome Walking的方法,对莱芜猪CuZnSOD基因cDNA和启动子区域进行克隆测序,分析基因结构和功能,并构建能在细胞中表达的真核表达载体。用QRT-PCR检测CuZnSOD基因的品种和组织差异表达,研究其表达对肉质性状和肉质抗氧化的影响。本研究主要分以下三个部分:1. CuZnSOD基因cDNA序列全长658 bp(GenBank登录号: GU944822),包含76 bp的5′UTR和120 bp的3′UTR序列。全部CDS序列462 bp,编码153个氨基酸,分子量为15.9 kDa,等电点PI为6.03。采用Genome Walking试剂盒扩增基因组的启动子序列,扩增得到1876bp的片段。CuZnSOD基因编码的氨基酸序列中,第3氨基酸残基处存在1个O-糖基化位点,第86氨基酸残基处存在1个N-糖基化位点。二级结构中α螺旋仅占1.31%。在进化过程中高度保守,与人、牛、小鼠和大鼠的编码区同源性分别为87.74%、87.66%、83.44%和83.23%;氨基酸序列同源性分别为90.26%、94.12%、92.21%和91.50%。基于蛋白序列所构建的分子进化树,表明猪与牛的亲缘关系最近。2.采用RT-PCR方法,以莱芜猪肌肉总RNA为模板扩增CuZnSOD基因的全长cDNA编码区序列,采用TA克隆技术,将目的片段插入到pUCm-T载体中进行鉴定,重组的质粒命名为pUCm-T-CuZnSOD。随后将CuZnSOD进一步克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中。用脂质体将经过测序、验证的重组pcDNA3.1(+)/CuZnSOD质粒转染到山羊毛囊外根鞘细胞中,用QRT-PCR检测CuZnSOD基因mRNA的表达。结果:成功构建了pcDNA3.1(+)/CuZnSOD真核表达质粒,转染山羊毛囊外根鞘细胞, QRT-PCR检测结果表明,所转染的CuZnSOD在山羊毛囊外根鞘细胞中成功表达。成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/CuZnSOD,为进一步研究CuZnSOD在肉质抗氧化的作用中奠定了基础。3.在mRNA水平上,CuZnSOD是一个广谱表达基因,在大脑、心脏、脾脏、肝脏、肾脏、肺、大肠、小肠、脊髓、肌肉、背膘和胃中都能检测到,同一个品种内CuZnSOD基因mRNA的表达存在明显的组织差异(P<0.05),其在肾脏、小肠和肺中表达量较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低。在肌肉、背膘和肝脏三种组织中CuZnSOD基因mRNA的表达存在明显的品种差异(P<0.05),并且CuZnSOD基因mRNA的表达始终是莱芜猪>鲁莱黑猪>大约克夏猪。CuZnSOD mRNA表达越高,SOD活性越高,MDA含量越低,肌肉的系水力越高、肉色越鲜艳,并且肉质越细嫩。

全文目录

中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
1 引言  13-19
  1.1 氧自由基与抗氧化酶  13-15
  1.2 铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）  15-16
    1.2.1 CuZnSOD 理化特性  15
    1.2.2 CuZnSOD 基因的研究  15-16
  1.3 CuZnSOD 与肉质的氧化  16-18
    1.3.1 肉色  16-17
    1.3.2 滴水损失  17
    1.3.3 嫩度  17
    1.3.4 氧化产物和MDA  17-18
  1.4 CDNA 末端快速扩增(RACE)技术  18
  1.5 本研究的目的和意义  18-19
2 材料与方法  19-35
  2.1 试验材料  19-22
    2.1.1 试验动物和细胞系  19-20
    2.1.2 网络资源及软件  20
    2.1.3 主要试剂和试剂盒  20
    2.1.4 主要仪器  20-21
    2.1.5 试验所用试剂的配制  21-22
  2.2 试验方法  22-35
    2.2.1 CuZnSOD 基因的CDNA 全长扩增  22-25
    2.2.2 CDNA 全长克隆测序  25-27
    2.2.3 CuZnSOD 基因启动子克隆  27-29
    2.2.4 蛋白质序列的生物信息学分析  29-31
    2.2.5 CuZnSOD 基因真核表达载体的构建  31-33
    2.2.6 CuZnSOD 基因在山羊毛囊外根鞘细胞中的表达  33-34
    2.2.7 CuZnSOD 基因组织表达谱分析  34
    2.2.8 肉质测定  34-35
    2.2.9 SOD 活性和MDA 含量的测定  35
    2.2.10 数据分析  35
3 结果与分析  35-48
  3.1 CuZnSOD 基因的CDNA 全长扩增  35-36
    3.1.1 总RNA 质量测定  35
    3.1.2 RACE 扩增结果  35-36
    3.1.3 菌液PCR 和酶切鉴定结果  36
  3.2 测序结果分析  36-37
  3.3 CuZnSOD 基因启动子序列分析  37-38
  3.4 CuZnSOD 生物信息学分析  38-44
    3.4.1 ORF 区的预测  38
    3.4.2 分子量和等电点分析  38
    3.4.3 蛋白质疏水性  38-39
    3.4.4 蛋白质信号肽预测  39-40
    3.4.5 跨膜区预测  40-41
    3.4.6 亚细胞定位预测  41
    3.4.7 蛋白质功能结构域预测  41
    3.4.8 糖基化和磷酸化位点预测  41-42
    3.4.9 序列间的多重比对和蛋白质氨基酸分子进化树  42-43
    3.4.10 蛋白质三级结构预测  43-44
  3.5 CuZnSOD 基因真核表达载体的鉴定  44
  3.6 山羊毛囊外根鞘细胞中CuZnSOD 基因表达检测  44-45
  3.7 CuZnSOD 基因的表达谱分析  45-47
    3.7.1 荧光定量PCR 的标准曲线和熔解曲线  45-46
    3.7.2 CuZnSOD 基因m RNA 相对表达量检测  46-47
  3.8 肉质特性  47
  3.9 SOD 活性和MDA 值  47
  3.10 CuZnSOD 基因mRNA 表达量与肉质抗氧化的相关性分析  47-48
    3.10.1 mRNA 相对表达量与SOD 活性和MDA 的相关分析  47-48
    3.10.2 mRNA 相对表达量与肉质相关分析  48
4 讨论  48-51
  4.1 CuZnSOD 生物信息学分析  48-49
  4.2 CuZnSOD 基因m RNA 的组织和品种差异表达  49-50
  4.3 CuZnSOD 基因m RNA 表达与肉质抗氧化的关系  50-51
5 结论  51-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
作者简介  59
攻读学位期间发表论文情况  59-60
硕士学位论文内容简介及自评  60

猪CuZnSOD基因的克隆、mRNA表达及其对肉质抗氧化性能的影响

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