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猪前脂肪细胞分化过程中抵抗素基因表达水平及其影响因素

作　者: 毋文静
导　师: 刘艳芬
学　校: 广东海洋大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 抵抗素前脂肪细胞分化猪
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的本研究旨在探讨抵抗素基因(RETN)在猪前脂肪细胞分化过程中表达水平的变化规律以及胰岛素、葡萄糖、地塞米松对RETN表达水平的影响。方法1、从1日龄仔猪皮下脂肪组织分离前脂肪细胞,于37℃、5%CO2、饱和湿度下进行原代培养,通过MTT法,油红O染色以及测定细胞内脂蛋白脂酶活性鉴定猪前脂肪细胞。2、用油红O染色法观察前脂肪细胞培养3、5、7、10d后细胞形态的变化,并用实时荧光定量PCR检测前脂肪细胞分化过程中RETN基因表达水平的变化。3、将增殖的猪前脂肪细胞随机分为3组,分别培养于含有胰岛素、葡萄糖和地塞米松的培养基中。培养液中胰岛素终浓度为0,10,100和1000 nmol/L;葡萄糖终浓度为0,5,10和20 mmol/L;地塞米松的终浓度为0,10,100和1000 nmol/L。每个浓度设三个重复。接种1d后将培养基更换为测试培养基即加入影响因子的培养基(记为0d),此后每隔2d换液一次。并于换液后的第3、5、10d后取样。通过油红O染色法观察胰岛素、葡萄糖、地塞米松对前脂肪细胞分化的影响,并用实时荧光定量PCR检测胰岛素、葡萄糖、地塞米松对RETN基因表达水平的影响。结果1、前脂肪细胞培养至第3d时,细胞内有少量脂滴出现,此后细胞内脂滴聚集,脂滴数量增加,体积逐渐增大,最后汇集成大脂滴充满细胞。低剂量的葡萄糖(5mM)和地塞米松(10nM)对前脂肪细胞分化的影响不明显,胰岛素、萄糖和地塞米松都有诱导前脂肪细胞分化的作用,随着影响因子的浓度增大而细胞分化速度加快,随培养时间的增加而分化程度增大。2、抵抗素在3,5,7,10d的相对表达量分别是14.31±1.29,5.58±0.29,2.25±0.08,1.61±0.01,相邻两时间点比较抵抗素的表达差异均有显著性意义(P<0.01)。3、与对照组相比,胰岛素能显著促进RETN的表达,此作用具有剂量依赖性;葡萄糖均能提高RETN的表达,且呈时间依赖性。4、地塞米松在低浓度(10nM)的情况下,短时间(3d)内可抑制抵抗素的表达,5天内对抵抗素表达影响较小,与对照组差异不显著(P>0.05);但长时间内可诱导抵抗素的表达,而地塞米松为100nM和1000nM时,对抵抗素表达的诱导作用呈剂量和时间依赖性(P<0.05)。结论1、在细胞分化过程中,抵抗素的表达量显著下降(p<0.01),提示RETN基因与前脂肪细胞脂肪代谢调节有关,其表达水平下调能促进前脂肪细胞分化。2、胰岛素能显著上调抵抗素的表达且呈剂量依赖性(P<0.05),;葡萄糖能诱导抵抗素的表达并呈时间依赖性(P<0.05);低剂量的地塞米松(10nM)在短时间(3d)内可以抑制抵抗素的表达,其表达量下降了4.3%,高剂量地塞米松均能诱导抵抗素的表达。3、尽管胰岛素、葡萄糖、地塞米松都能不同程度地促进抵抗素基因表达,但均不能改变猪前脂肪细胞分化过程中抵抗素表达水平下降的趋势。

全文目录

摘要 6-8Abstract 8-131 前言 13-20 1.1 RETN 表达调控研究进展 13-18 1.1.1 抵抗素及其基因的结构 13-14 1.1.2 RETN 表达 14-15 1.1.3 RETN 表达的调控 15-18 1.1.4 小结 18 1.2 研究目的和意义 18-202 猪前脂肪细胞的分离与鉴定 20-28 2.1 试验材料 20-21 2.1.1 动物 20 2.1.2 主要的仪器与试剂 20-21 2.2 试验方法 21-23 2.2.1 猪前脂肪细胞的原代培养 21-22 2.2.2 前脂肪细胞的传代培养 22 2.2.3 猪前脂肪细胞的鉴定 22-23 2.3 结果 23-25 2.3.1 猪前脂肪细胞的生长曲线 23 2.3.2 细胞形态变化 23-24 2.3.3 猪前脂肪细胞分化中脂蛋白脂酶（LPL）活性 24-25 2.4 讨论 25-27 2.4.1 关于脂肪细胞的培养 25 2.4.2 细胞的增长规律 25-26 2.4.3 细胞的形态学变化 26 2.4.4 关于脂肪细胞的分化 26-27 2.5 小结 27-283 猪前脂肪细胞分化过程中RETN 基因的表达 28-39 3.1 材料 28-29 3.1.1 试验动物 28 3.1.2 仪器与设备 28-29 3.2 试验方法 29-33 3.2.1 猪前脂肪细胞的培养 29 3.2.2 细胞形态观察 29-30 3.2.3 细胞总RNA 的提取 30 3.2.4 引物设计与合成 30 3.2.5 逆转录聚合酶链式反应 30-31 3.2.6 PCR 产物的检测 31-32 3.2.7 SYBR 荧光实时定量PCR 32-33 3.2.8 数据统计分析 33 3.3 结果 33-37 3.3.1 细胞形态观察 33 3.3.2 RNA 电泳结果 33-34 3.3.3 PCR 产物鉴定 34-35 3.3.4 实时荧光定量PCR 产物的特异性检验 35-36 3.3.5 实时荧光定量RT-PCR 的扩增效率 36 3.3.6 抵抗素基因(RETN)在猪前脂肪细胞中的表达 36-37 3.4 讨论与分析 37-38 3.4.1 总RNA 的提取 37 3.4.2 RETN 基因荧光定量PCR 检测方法的建立 37-38 3.4.3 前脂肪细胞分化过程中 RETN 基因表达的变化 38 3.5 小结 38-394 胰岛素，葡萄糖及地塞米松对猪前脂肪细胞中RETN 基因的表达影响 39-56 4.1 材料 39-40 4.1.1 试验动物 39 4.1.2 仪器与设备 39-40 4.2 方法 40-42 4.2.1 猪前脂肪细胞的单层培养 40 4.2.2 试验设计 40-41 4.2.3 细胞形态观察 41 4.2.4 细胞总RNA 提取 41-42 4.2.5 RT 合成RETN 基因cDNA 42 4.2.6 RETN 基因的表达水平测定 42 4.2.7 统计学分析 42 4.3 结果 42-52 4.3.1 各影响因子对猪前脂肪细胞形态的影响 42-45 4.3.2 RNA 完整性 45-47 4.3.3 PCR 产物的特异性分析 47-48 4.3.4 胰岛素、葡萄糖及地塞米松对猪脂肪细胞RETN 表达水平的影响 48-52 4.4 讨论 52-55 4.4.1 胰岛素对前脂肪细胞形态和抵抗素表达量的影响 52-53 4.4.2 葡萄糖对前脂肪细胞形态和抵抗素表达量的影响 53-54 4.4.3 地塞米松对前脂肪细胞形态和抵抗素表达量的影响 54-55 4.5 小结 55-565 结论及创新点 56-57 5.1 结论 56 5.2 创新点 56-57参考文献 57-64致谢 64-65个人简介 65-66导师简介 66

猪前脂肪细胞分化过程中抵抗素基因表达水平及其影响因素

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