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丁酸钠处理对奶牛成纤维细胞周期、活性、凋亡和组蛋白乙酰化的影响

作　者: 柴磊磊
导　师: 易建明
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 丁酸钠组蛋白乙酰化奶牛成纤维细胞核移植细胞周期细胞凋亡
分类号: S823
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

体细胞核移植技术是动物胚胎工程中一种比较重要的技术,对于体外胚胎的大量生产具有十分重要的意义,但是就目前的发展状况来看,这项技术的成功率还比较低,不能用于实际的生产。其中造成这样的结果的一个比较重要的原因就是供体细胞核的不完全重编程。所以本实验从供体组蛋白乙酰化入手,研究组蛋白乙酰化对于重编程的影响。针对以上的问题,本实验以第6代牛胎儿成纤维细胞作为供体细胞,以牛卵母细胞作为受体进行研究,得到如下结果与结论：1.用3 mmol/L丁酸钠(NaBu)分别处理供体细胞0、48和72、96h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术检测处理之后的细胞的组蛋白H3K9、14乙酰化水平。结果显示：随着NaBu处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K9、14乙酰化水平不断增高；用NaBu处理之后的成纤维细胞就行核移植,以3mmol/L NaBu处理供体细胞48h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(32.5%vs22%,p<0.05)。结论：3 mmol/LNaBu处理供体细胞48h更易使重编程的过程发生,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实NaBu是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程。2.采用组蛋白乙酰化酶抑制剂(NaBu)处理成纤维细胞,除了其对细胞组蛋白乙酰化有影响之外,考虑其对细胞特性的一些影响。尝试着确定NaBu的最佳处理浓度和最佳处理时间,使其既不影响体细胞生物学特性,又可提高供体细胞组蛋白乙酰化状态的方法,从而提供一种提高体细胞克隆动物效率的方法。实验中用NaBu分别处理奶牛成纤维细胞0、48、72、96h,采用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的情况,用MTT法检测NaBu对成纤维细胞活性的影响。结果显示：处理组细胞形态发生了改变,不规则生长,细胞之间接触不紧密,还出现脱壁死亡的现象。经3 mmol/L NaBu处理的细胞在G0/G1期的百分比与未经处理的对照组相比略有降低；从琼脂糖凝胶电泳图谱上可见从72h开始出现拖带现象,说明细胞的DNA开始有断裂。用Annexin V联合PI法检细胞凋亡,发现随着处理时间的加长,处理组与对照组相比发生凋亡的和死细胞的比例显著增加。总之,此实验的结果说明用3 mmol/LNaBu对供体细胞处理48h,细胞凋亡相对较低,处于G0/G1期的细胞比例达到75%以上,但是高浓度处理则会导致DNA断裂与细胞凋亡显著增加,虽然细胞的乙酰化程度有很高的提高,不但是能用于体细胞克隆动物的生产。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
缩略语表  12-13
第一章文献综述  13-26
  1 核移植研究进展  13-15
    1.1 哺乳动物胚胎细胞核移植的研究  14
    1.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植的研究  14-15
    1.3 哺乳动物体细胞核移植的研究  15
  2 影响核移植效率的因素  15-18
    2.1 供体细胞对于体细胞核移植的影响  15-17
      2.1.1 各种类型的供体细胞核移植的影响  15-16
      2.1.2 处于各个细胞周期的供体细胞对核移植的影响  16
      2.1.3 处于不同传代次数的供体细胞对核移植的影响  16
      2.1.4 不同年龄的供体细胞对核移植的影响  16-17
    2.2 卵母细胞对于体细胞核移植的影响  17-18
      2.2.1 卵母细胞的停滞期和预先激活  17
      2.2.2 卵母细胞的去核方法  17-18
      2.2.3 重组胚的激活和培养  18
  3 体细胞核移植诱导的表观遗传修饰  18-23
    3.1 组蛋白乙酰化  19-20
      3.1.1 组蛋白乙酰化和去乙酰化的作用机理  19-20
    3.2 DAN甲基化  20-21
      3.2.1 DNA甲基化的作用机理  20-21
    3.3 X染色体失活  21
    3.4 基因组印记  21-22
    3.5 端粒和端粒酶活性  22-23
  4 组蛋白乙酰化与体细胞核移植  23-26
    4.1 组蛋白乙酰化与体细胞核移植异常  23-24
    4.2 组蛋白去乙酰化酶抑制剂的种类  24
    4.3 组蛋白去乙酰化酶抑制剂在体细胞核移植上的应用  24-26
第二章 NaBu处理供体细胞对组蛋白乙酰化和核移植的影响  26-33
  1 材料和方法  26-29
    1.1 主要仪器设备及试剂  26-29
      1.1.1 主要仪器设备  26-27
      1.1.2 主要试剂  27
      1.1.3 奶牛成纤维细胞制备  27
      1.1.4 奶牛卵母细胞的体外成熟  27-28
      1.1.5 牛卵母细胞核移植  28
      1.1.6 重构胚的激活及体外培养  28
      1.1.7 免疫荧光染色  28-29
      1.1.8 试验设计  29
      1.1.9 试验数据统计分析  29
  2 结果与分析  29-31
    2.1 NaBu不同时间处理对供体细胞组蛋白H3K9、14乙酰化水平的影响  29-30
    2.2. 供体细胞经NaBu处理对克隆胚胎发育能力的影响  30-31
  3 讨论  31-32
  4 小结  32-33
第三章去乙酰化酶抑制剂(NaBu)对供体细胞特性的影响  33-44
  1 材料与方法  33-36
    1.1 材料  33-34
      1.1.1 主要仪器  33-34
      1.1.2 试剂  34
    1.2 方法  34-36
      1.2.1 去乙酰化酶抑制剂(NaBu)处理供体成纤维细胞  34
      1.2.2 去乙酰化酶抑制剂(NaBu)对细胞周期的影响  34-35
      1.2.3 去乙酞化酶抑制剂(NaB)u对细胞凋亡的影响  35
        1.2.3.1 DNA ladder法检测细胞凋亡  35
        1.2.3.2 采用Annexin Ⅴ联合PI法检测细胞的凋亡  35
      1.2.4 去乙酰化酶抑制剂(NaBu)对细胞相对数和活力的影响  35-36
  2 结果与分析  36-40
    2.1 NaBu对成纤维细胞的形态的影响  36
    2.2 NaBu对细胞周期的影响  36-38
    2.3 NaBu对细胞凋亡的影响  38-40
    2.4 NaBu对细胞相对数和细胞活力的影响  40
  3 讨论  40-43
    3.1 NaBu处理成纤维细胞形态学变化  40-41
    3.2 NaBu处理对细胞周期的影响  41
    3.3 NaBu对细胞凋亡的影响  41-42
    3.4 NaBu对细胞生长的抑制  42-43
  4 小结  43
  5 本研究创新处  43-44
参考文献  44-49
致谢  49

丁酸钠处理对奶牛成纤维细胞周期、活性、凋亡和组蛋白乙酰化的影响

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