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鸡新城疫抗体检测试纸条的研制及初步应用

作　者: 贾清
导　师: 毕丁仁
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒抗体 HN蛋白 胶体金 免疫层析技术
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 150次
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内容摘要


鸡新城疫(Newcastle disease, ND)是由副粘病毒科腮腺炎病毒属的1型副粘病毒(Paramyxo virus)新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种极易传染的毁灭性疾病,该疾病严重地阻碍了世界养禽业的发展。检测鸡群的免疫水平和评价鸡群的免疫状况对于该病的控制有着重要的意义。而目前,新城疫抗体检测技术主要局限于实验室检测,在临床应用时有一定的局限性。本研究利用原核表达血凝素神经氨酸酶蛋白,结合胶体金免疫层析技术,建立了鸡新城疫病毒抗体快速检测方法,取得以下研究结果：1.新城疫血凝素神经氨酸酶蛋白的原核表达及纯化用本实验室保存的NDV La Sota株通过鸡胚传代,收取尿囊液后提取病毒RNA,分别设计带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的两对引物,利用RT-PCR扩增出HN基因的全长和去信号肽和跨膜区序列的片段,将两种扩增产物分别克隆进pGEX-KG载体,成功构建了重组表达质粒pKG-HN和pKG-HNde-sp,测序后,两条基因大小分别为1734 bp和1593 bp,扩增序列与GenBank上报道的La Sota株的基因核苷酸序列的同源性为99%。将构建好的pKG-HN和pKG-HNde-sp质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导后,经SDS-PAGE电泳分析,重组表达的蛋白分子量分别约为89 KD和80 KD。经过对表达蛋白的条件进行优化,结果显示,pKG-HNde-sp在温度为37℃、IPTG浓度为1‰和诱导5 h的表达量最高,Western-Blot分析表明,表达蛋白有较好的免疫学活性。2.鸡新城疫病毒抗体快速检测试纸条的建立用柠檬酸三钠还原法制备20 nm的胶体金,用鼠抗鸡IgG Fc单抗标记,标记的最佳pH为8.0,最佳标记量为9.6μL1.0mg/mL。以金标鼠抗鸡IgG Fc单抗为探针,以兔抗鼠IgG作为质控线,以纯化的HN蛋白作为检测线的捕获试剂,初步建立了能检测鸡新城疫抗体的胶体金快速检测试纸条。兔抗鼠IgG的最佳喷膜浓度为1.0mg/mL, HN表达蛋白的最佳喷膜浓度为1.1 mg/mL。该试纸条与传染性法氏囊、传染性支气管炎、禽流感H9亚型、禽流感H5亚型、鸡毒霉形体等阳性血清和无特定病原体鸡阴性血清反应均为阴性；灵敏度与血凝抑制试验结果一致。该方法操作简单,特异性强,灵敏度高,可用于鸡新城疫血清抗体水平的检测。3.鸡新城疫抗体快速检测试纸条的初步应用用本试验制备的鸡新城疫抗体快速检测试剂盒进行临床应用,检测240份血清,其中试纸条检测出阳性血清222份,检出率为92.5%(222/240)；血凝抑制试验(HI)检测出阳性血清220份,检出率为91.6%(220/240),二者的符合率为99.1%(220/222),此结果表明,本试剂盒与HI试验结果基本一致,临床上可代替HI试验进行新城疫抗体效价的检测。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表(Abbreviation)  10-11
1 文献综述  11-21
  1.1 新城疫病毒概述  11-16
    1.1.1 病毒结构  11-12
    1.1.2 基因分型  12-13
    1.1.3 强弱毒株  13-14
    1.1.4 病毒的变异  14
    1.1.5 流行病学  14-15
    1.1.6 新城疫致病机理  15-16
  1.2 新城疫检测方法研究进展  16-19
    1.2.1 血凝和血凝抑制试验  16-17
    1.2.2 反转录-聚合酶链式反应技术  17
    1.2.3 核酸探针技术  17
    1.2.4 联合巢式PCR和以磁珠为探针的技术  17-18
    1.2.5 酶联免疫吸附试验  18
    1.2.6 RNA指纹图谱法  18
    1.2.7 基因芯片技术  18-19
    1.2.8 胶体金免疫层析技术  19
  1.3 新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶蛋白的研究进展  19-21
    1.3.1 HN核苷酸序列  19-20
    1.3.2 HN蛋白的结构  20
    1.3.3 HN蛋白的应用  20-21
2 目的与意义  21-22
3 材料与方法  22-37
  3.1 试验材料  22-26
    3.1.1 试验病毒和菌种  22
    3.1.2 仪器设备  22-23
    3.1.3 药品与试剂  23-24
    3.1.4 主要溶液配制  24-26
  3.2 试验方法  26-37
    3.2.1 新城疫病毒HN基因的克隆表达及蛋白的纯化  26-33
    3.2.2 鸡新城疫抗体检测试纸条的研制  33-34
    3.2.3 胶体金免疫层析试纸条的建立  34-35
    3.2.4 性能测试  35-36
    3.2.5 快速检测鸡新城疫抗体诊断试剂盒的组装和初步应用  36-37
4 结果与分析  37-43
  4.1 新城疫病毒HN基因的克隆与序列分析  37-39
    4.1.1 新城疫病毒RNA的提取  37
    4.1.2 HN基因的扩增  37
    4.1.3 PCR回收产物和空KG质粒的酶切鉴定  37-38
    4.1.4 克隆质粒的酶切鉴定  38-39
    4.1.5 基因的序列分析  39
    4.1.6 蛋白的诱导表达分析  39
  4.2 蛋白表达条件的优化  39
  4.3 蛋白的纯化  39
  4.4 抗鸡IgG Fc单抗的纯化  39-41
  4.5 封闭液的选择  41
  4.6 蛋白喷膜浓度  41
  4.7 试纸条性能检测  41-43
    4.7.1 特异性试验  41
    4.7.2 敏感性试验  41-42
    4.7.3 稳定性试验  42-43
    4.7.4 重复性试验  43
  4.8 检测试剂盒的应用  43
5 讨论  43-47
  5.1 新城疫HN基因的克隆  43-44
  5.2 蛋白的表达  44-46
  5.3 试纸条的优化  46-47
    5.3.1 蛋白包被量的优化  46
    5.3.2 同类试纸条的对比  46
    5.3.3 保存期的优化  46-47
6 结论  47-48
参考文献  48-56
致谢  56

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鸡
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