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布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法与血清快速诊断试纸的初步研究

作　者: 孟茹
导　师: 陈创夫
学　校: 石河子大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 布鲁氏菌 荧光定量PCR 布鲁氏菌血清 胶体金免疫层析
分类号: R516.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 60次
引　用: 1次
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内容摘要


布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌引起的一种人兽共患传染病。危害人畜健康并给畜牧业发展造成巨大损失。该病在世界范围内广泛流行,我国也是布病的高发国家,新疆、青海、西藏、内蒙古等地区尤为严重,有效的检疫是预防和控制布鲁氏菌病的重要手段,传统检测方法存在易发生交叉反应、操作繁琐、敏感性低等缺点,研究敏感、特异、快速、适合临床应用的检测方法已引起了国内外的高度重视,本实验建立的布鲁氏菌实时荧光定量PCR与血清快速诊断试纸检测方法,将会为基层布病检疫和防控提供技术支持。本实验所做的工作及主要成果如下：1.布鲁氏菌BP26蛋白的表达、纯化。将bp26基因克隆到pGM-T载体,进行酶切、PCR及测序鉴定后,构建重组质粒pET-28a-BP26,转化表达菌并诱导表达、纯化,Western-blot分析其免疫原性。结果表明正确构建了pGM-T-BP26,成功表达了BP26融合蛋白,SDS-PAGE检测表明获得了高表达量、高纯度的蛋白,并且布鲁氏菌阳性血清能特异性与BP26蛋白相结合,表明具有免疫原性,为后续的免疫学检测试验奠定了基础。2.建立基于布鲁氏菌BP26蛋白的血清快速检测胶体金免疫层析试纸条。以胶体金标SPA和布鲁氏菌BP26蛋白制备免疫层析试纸条,并对其特异性、敏感性、准确性和稳定性进行检测。结果试纸条检测布鲁氏菌阳性血清为两条线,检测其他细菌抗血清只有质控线显色,5-10min可观察结果,具有良好的特异性；采用该方法、琥红平板、试管凝集分别检测45份布鲁氏菌M5免疫的小鼠血清,阳性率分别为95.6%(43/45)、86.7%(39/45)和93.3%(42/45),试纸条与琥红平板的符合率为90.6%,与试管凝集的符合率为97.9%,试纸条可检出1：100倍稀释的羊阳性血清；1：128倍稀释的小鼠阳性血清,表明具有较好的敏感性；本试纸条在4℃可保存6个月,表明该检测方法具有较高的稳定性。3.利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布鲁氏菌和结核杆菌的方法。筛选布鲁氏菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布鲁氏菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布鲁氏菌Tm值为88℃-89℃,结核杆菌Tm值为90℃-92℃,对其他供试的菌株则为阴性；该方法对布鲁氏菌的DNA最低检出量为20 copies/ul,结核杆菌为50 copies/ul,两病原都存在时为100copies/ul,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对34份结核痰样、11份布鲁氏菌基因组DNA及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。结果证明本实验建立的方法可用于同时检测布鲁氏菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和准确性。

全文目录


中文摘要  5-6
Abstract  6-8
目录  8-10
英文缩略词表  10-11
引言  11-12
第一章 文献综述 布鲁氏菌外膜蛋白及检测技术研究进展  12-19
  1 布鲁氏菌外膜蛋白  12-15
    1.1 OMP10  12-13
    1.2 OMP17  13
    1.3 OMP19  13
    1.4 OMP25  13-14
    1.5 OMP28  14
    1.6 OMP31  14-15
  2 布鲁氏菌检测技术的研究进展  15-19
    2.1 病原学检测  15-17
    2.2 血清学检测  17-19
第二章 实验研究  19-57
  试验一 布鲁氏菌外膜蛋白BP26的原核表达及纯化  19-29
    1 材料与方法  19-25
      1.1 材料  19-20
      1.2 方法  20-25
    2 结果  25-27
      2.1 BP26基因的扩增与重组质粒鉴定  25-26
      2.2 BP26蛋白在大肠杆菌DE3中的表达  26-27
      2.3 BP26蛋白的纯化及Western Blot分析  27
    3 讨论  27-29
  试验二 检测布鲁氏菌抗体的胶体金免疫层析方法的建立  29-44
    1 材料与方法  29-36
      1.1 菌种与实验血清  29
      1.2 主要试剂及耗材  29-31
      1.3 方法  31-36
    2 结果  36-41
      2.1 胶体金及免疫金质量鉴定  36-38
      2.2 抗体与胶体金结合的最佳pH和最佳浓度  38
      2.3 试纸条结果判定  38-39
      2.4 特异性、敏感性、准确性、稳定性的检测结果  39-41
    3 讨论  41-44
      3.1 BP26蛋白在布鲁氏菌病诊断中的应用  41
      3.2 胶体金的制备  41-42
      3.3 SPA在诊断中的应用  42
      3.4 SPA与胶体金结合的最佳pH的确定  42
      3.5 胶体金标记SPA最佳浓度的确定  42-43
      3.6 免疫胶体金的纯化  43
      3.7 层析材料选择及处理  43-44
  试验三 布鲁氏菌的实时荧光定量检测方法的建立  44-57
    1 材料与方法  45-50
      1.1 材料  45
      1.2 方法  45-50
    2 结果  50-55
      2.1 质粒标准品的制备  50-51
      2.2 二重实时荧光定量PCR反应体系的建立及优化  51-52
      2.3 Tm值的确定  52-53
      2.4 特异性试验  53
      2.5 敏感性试验  53-54
      2.6 稳定性试验  54-55
      2.7 样品检测结果  55
    3 讨论  55-57
参考文献  57-66
第三章 结论  66
创新点  66-67
致谢  67-68
作者简介  68-69
导师评阅表  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 传染病 > 杆菌传染病 > 布鲁（Bruce）氏菌病（波形热、地中海热、马尔他岛热）
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