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磺胺对甲氧嘧啶胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

作　者: 方钲
导　师: 卞建春
学　校: 扬州大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 磺胺对甲氧嘧啶 残留检测 单抗 胶体金 免疫层析试纸条
分类号: S859.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 152次
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内容摘要


磺胺对甲氧嘧啶(Sulfametoxydiazine,SMD)是磺胺类药物的一种,其抗菌范围广、副作用小,乙酰化率低,且溶解度高。兽医临床上SMD常用于敏感菌所致的泌尿生殖道感染、呼吸道感染、消化道感染和皮肤软组织感染及作饲料添加剂。但大量或长期使用可使其在动物体内蓄积,造成药物残留,对人类的健康构成潜在危害。胶体金免疫层析技术具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点,因而特别适合于广大基层兽医人员用来大批量检测和大面积普查等,具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。本试验应用胶体金免疫层析技术,进行磺胺对甲氧嘧啶残留检测方法的研究,以期建立一种快速检测磺胺对甲氧嘧啶残留的方法。1、SMD单克隆抗体的制备及鉴定。本研究将杂交瘤细胞株接种到小鼠体内,采用体内诱生腹水法制备了单抗的腹水。用重氮法和戊二醛法将SMD偶联到牛血清白蛋白(BSA),制成了人工抗原SMD-BSA,并用紫外分光光度计进行了扫描鉴定。腹水经辛酸-硫酸铵法纯化后,单抗蛋白浓度为2.27mg/mL,用包被抗原SMD-BSA对单抗进行质量鉴定,抗体工作浓度为1：10000,抗原工作浓度为1：4000,用确定的最佳抗原抗体工作浓度进行CiELISA测定,标准曲线为Y=0.2962X+0.0684(R2=0.9952),计算出IC50为28ng/mL,LOD为1.91ng/mL,LOQ为8.63ng/mL，通过对其他六种磺胺类药物的交叉反应实验表明该SMD单抗特异性较好。2、SMD胶体金快速检测试纸条的研制。采用柠檬酸三钠还原法制备24nm胶体金,鉴定后用胶体金标记纯化后的单克隆抗体,并将金标抗体吸附在玻璃纤维素膜上。将抗原SMD-BSA和羊抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维素膜上组装成试纸条。然后对试纸条的各个条件进行优化,确定了最佳条件。用该试纸条检测SMD标准液,检测限为100ng/mL。试纸条对SQ、SD、ST、SMZ、SDM、SA交叉反应较弱,特异性较好。经测试,不同批次间试纸条重复性较好,4℃条件下可保存10周。3、SMD胶体金快速检测试纸条的初步应用。对牛奶、鸡蛋、蜂蜜样本进行添加回收试验,经检测在牛奶中的药物添加回收率为85.3%～104.6%；鸡蛋中的添加回收率为：81.4%～113.1%；蜂蜜中的添加回收率为73.8%～89.2%。并用处理过的无SMD成份的牛奶、鸡蛋、蜂蜜样本添加SMD标准液,用试纸条进行检测,符合率分别为88%、84%、76%。实验表明,本实验所制试纸条可用于动物食品中磺胺对甲氧嘧啶残留的检测,也为其他兽药残留检测试纸条的研制提供了借鉴。

全文目录


中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
符号说明  10-11
第一章 前言  11-26
  1 磺胺类药物概述  11-14
    1.1 磺胺类药物的理化性质  12
    1.2 抗菌作用机理  12
    1.3 体内代谢  12-13
    1.4 毒性作用  13
    1.5 耐药性  13
    1.6 动物源性食品中磺胺类药物的残留及危害  13-14
  2 磺胺对甲氧嘧啶残留检测研究进展  14-19
    2.1 磺胺对甲氧嘧啶概述  14-15
    2.2 动物源性食品中磺胺对甲氧嘧啶残留的检测  15-19
  3 胶体金免疫技术及在兽药残留检测中的应用  19-25
    3.1 胶体金概述  20
    3.2 胶体金的制备  20-21
    3.3 胶体金标记抗体的制备与纯化  21-22
    3.4 免疫层析技术  22
    3.5 试纸条的组装  22-23
    3.6 免疫胶体金技术在兽药残留中的应用  23-24
    3.7 免疫胶体金技术的前景与展望  24-25
  4 本研究的目的与意义  25-26
第二章 实验材料与方法  26-41
  1 实验材料  26-29
    1.1 主要试剂  26
    1.2 试纸条材料  26
    1.3 主要实验仪器  26-27
    1.4 实验动物及细胞株  27
    1.5 实验样品材料  27
    1.6 主要溶液系统  27-29
  2 实验方法与步骤  29-41
    2.1 胶体金的制备与鉴定  29-30
    2.2 抗体制备与鉴定  30-32
    2.3 胶体金标记抗体的制备  32-34
    2.4 包被抗原的合成与鉴定  34-36
    2.5 胶体金免疫层析试纸条条件选择及优化  36-37
    2.6 试纸条的组装  37-38
    2.7 试纸条的测试  38-41
第三章 结果与分析  41-55
  1 胶体金的制备与鉴定  41-42
    1.1 肉眼观察  41
    1.2 紫外扫描鉴定  41-42
  2 SMD单克隆抗体的制备与鉴定  42-44
    2.1 纯化后腹水蛋白浓度测定  42
    2.2 抗原抗体最佳工作浓度  42-43
    2.3 SMD单抗灵敏度的检测  43-44
    2.4 SMD抗体特异性鉴定  44
  3 胶体金标记抗体的制备  44-46
    3.1 胶体金标记抗体最适稳定量的测定  44-45
    3.2 胶体金标记抗体最适pH的测定  45
    3.3 金标抗体的活性检测  45-46
  4 包被抗原的合成与鉴定  46-47
    4.1 包被原蛋白浓度的测定  46
    4.2 包被原的紫外扫描鉴定  46-47
    4.3 两种包被原的筛选  47
  5 胶体金免疫层析试纸条条件选择及优化  47-51
    5.1 试纸条组成材料的选择  47-48
    5.2 各溶液条件的选择  48-49
    5.3 免疫层析试纸条条件优化  49-51
  6 试纸条的检测  51-55
    6.1 检测结果的判定  51
    6.2 试纸条检测限的确定  51-52
    6.3 试纸条交叉反应试验  52-53
    6.4 重复性试验  53
    6.5 保存实验  53
    6.6 实际样品添加回收试验  53-54
    6.7 试纸条检测样本符合率测定  54-55
第四章 讨论  55-60
  1 抗体的制备与纯化  55
  2 胶体金制备与颗粒的选择  55-56
  3 胶体金标记抗体的制备  56
  4 硝酸纤维素膜的选择与处理  56-57
  5 膜材料的处理  57
  6 样品垫和金标结合垫的选择  57-58
  7 金标抗体喷涂量和抗原包被浓度的选择  58
  8 试纸条的组装与保存  58
  9 样品添加回收试验及与ELISA法的比较  58-59
  10 还需改进的方面  59-60
全文结论  60-61
参考文献  61-68
致谢  68-69

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医毒物学
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