学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

犬、猫狂犬病病毒抗体检测方法的建立

作　者: 范晓娟
导　师: 李刚
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 狂犬病病毒 N蛋白 ELISA 胶体金免疫层析抗体
分类号: S854.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 96次
引　用: 1次
阅　读: 论文下载

内容摘要

狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患病。迄今为止还没有有效的方法治疗狂犬病，该病一旦发作，死亡率几乎为100%。自20世纪50年代以来，我国狂犬病疫情出现3次流行高峰，目前正处于第三次高峰，而且近年来仍继续增长。面临严峻的疫情，对狂犬病病毒的主要宿主犬、猫进行免疫是预防和控制狂犬病的关键。但犬、猫免疫是否有效，需要有效的方法来检测其体内的抗体。鉴于以上所述，本研究利用分子生物学和现代免疫学技术建立了犬、猫狂犬病病毒抗体的通用型检测方法。经RT-PCR扩增狂犬病病毒Flury LEP毒株N基因，将该片段克隆至原核表达载体pET-32a(+)中，将重组质粒pET-RV N转化至宿主菌E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表明重组RV N蛋白以包涵体形式表达，其大小约为70 ku，Western blot分析表明重组N蛋白具有良好的抗原性。用纯化的重组RV N蛋白作为诊断抗原，建立了检测犬、猫狂犬病病毒抗体的SPA-ELISA方法。通过优化反应条件确定了抗原的最佳包被浓度为6μg/mL；血清最佳稀释度为1：200；SPA-HRP最适工作浓度为1：2000。应用此方法对临床犬、猫的血清样品进行检测，并与以狂犬病病毒作为包被抗原的商品化ELISA试剂盒比较，其两者的符合率为96.67%，结果表明基于重组N蛋白的SPA-ELISA方法适用于检测大批量样品，监测犬、猫群体中狂犬病抗体水平。采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，并将其标记SPA，将金标SPA包被至玻璃纤维膜上制备金标垫，将重组RV N蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上，建立了一种检测犬、猫RV抗体的通用型胶体金免疫层析方法。胶体金免疫层析试纸条与商品化ELISA试剂盒检测93份临床血清，两者的符合率为94.62%。该方法检测速度快，15 min内可出结果，特异性强，操作简便，无需仪器设备，可广泛应用于基层。采用RT-PCR扩增狂犬病病毒Flury LEP毒株G基因。利用Bac to Bac体系，将RV G基因克隆至pFastBac HT A，将重组质粒pFastBac-RV G转化至DH10Bac感受态细胞中，经同源重组获得杆状病毒穿梭质粒Bacmid-RV G，转染昆虫细胞sf21，经PCR鉴定获得含有RV G基因的重组杆状病毒，Western blot分析RV G已在昆虫细胞中成功表达，大小约为60 ku，为进一步的研究提供参考依据。本研究利用基因工程方法成功获得了纯化的重组RV N蛋白，并以重组RV N蛋白为抗原蛋白，建立了检测犬、猫狂犬病病毒抗体的SPA-ELISA和胶体金免疫层析方法，具有较高的特异性和灵敏度，为检测RV抗体试剂盒的研制奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-10
英文缩略表  10-11
第一章绪论  11-18
  1.1 狂犬病  11-14
  1.2 胶体金免疫层析  14-18
第二章狂犬病病毒FLURY LEP 毒株N 基因的克隆与原核表达  18-33
  2.1 实验材料  18-22
  2.2 方法  22-27
  2.3 结果  27-31
  2.4 讨论  31-33
第三章检测犬、猫狂犬病病毒抗体SPA - ELISA 方法的建立  33-40
  3.1 实验材料  33-34
  3.2 方法  34-35
  3.3 结果  35-39
  3.4 讨论  39-40
第四章检测犬、猫狂犬病病毒抗体胶体金免疫层析的建立  40-50
  4.1 实验材料  40-41
  4.2 方法  41-43
  4.3 结果  43-49
  4.4 讨论  49-50
第五章狂犬病病毒FLURY LEP 毒株G 基因的克隆与真核表达  50-61
  5.1 实验材料  50-51
  5.2 方法  51-55
  5.3 结果  55-59
  5.4 讨论  59-61
第六章全文结论  61-62
  6.1 狂犬病病毒FLURY LEP 株N 基因的克隆与原核表达  61
  6.2 检测犬、猫狂犬病病毒抗体SPA - ELISA 方法的建立  61
  6.3 检测犬、猫狂犬病病毒抗体胶体金免疫层析的建立  61
  6.4 狂犬病病毒FLURY LEP 株G 基因的克隆与真核表达  61-62
参考文献  62-66
致谢  66-67
作者简历  67

犬、猫狂犬病病毒抗体检测方法的建立

内容摘要

全文目录

相似论文