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水分胁迫下小麦叶片类脱水素的表达与亚细胞定位的研究

作　者: 豆玲
导　师: 张林生
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦脱水素胶体金免疫电镜水分胁迫表达
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

植物在干早胁迫下会产生多种逆境响应蛋白,胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)中D-11族脱水蛋白(dehydrin)是其中之一,该蛋白富含甘氨酸和赖氨酸,具有高度亲水性,是一种热稳定蛋白,脱水蛋白含有其特殊的保守区,目前发现有3类非常保守的区域,即K、S和Y片段,其中K片段是所有脱水蛋白都具有的,从而可利用合成K-片段同源多肽的抗体来检测和定位脱水蛋白。脱水素存在于植物细胞的各个部位,一般存在于细胞核和细胞质中,在线粒体、质膜附近也有分布,不同植物组织在不同胁迫条件下(干旱、盐渍、低温等)诱导产生的脱水素在细胞内的分布各不相同。在细胞核内脱水素可存在于常染色质、异染色质、核膜和核仁中;在细胞核外主要存在于细胞质基质中,少量存在于细胞器中。本研究以抗旱性较强‘陕合6号’和抗旱性较弱‘郑引1号’小麦为试验材料,采用PEG胁迫处理小麦幼苗,利用胶体金免疫电镜技术及Westernblot方法,分析水分胁迫下小麦叶片类脱水素的表达、在亚细胞结构上的分布,结合其细胞膜相对透性和可溶性蛋白的变化,了解小麦叶片类脱水素在细胞空间的分布与其抗旱功能之间的关系。主要获得以下结论:1、水分胁迫处理初期(4～8 h)金颗粒主要分布在细胞质,细胞核中仅有少量表达,细胞膜中未见金颗粒分布;处理中期(12～24 h)金颗粒主要分布在细胞质和细胞核,细胞器和细胞膜中有零星分布;后期(36～48 h)大量金颗粒富集于细胞质膜附近;复水24 h后细胞质和细胞核中金颗粒相对增多,质膜附近相对减少。结果表明,植物受到短期干旱胁迫时脱水蛋白主要分布在细胞质中,随着胁迫时间的延长,脱水素大量聚集在质膜附近,说明不同程度干旱其脱水素在细胞中的分布不同。以叶片组织不进行胁迫处理和省却脱水蛋白抗体作阴性对照,几乎未发现金颗粒,说明脱水蛋白是在水分胁迫诱导下表达。两个品种在胁迫36 h之前细胞质金颗粒数目多于细胞核,而36 h后细胞核金颗粒数目多于细胞质,表明细胞质中的富集先于细胞核。2、Western blot显示,水分胁迫处理各时期37 kD脱水素条带在正常供水情况下未出现,但是随胁迫时间延长,该蛋白条带逐渐加深,表明此脱水蛋白表达量增加,复水之后逐渐消失。不同品系脱水蛋白表达有一定的差异,抗旱性较强陕合6号脱水蛋白表达量高于抗旱性较弱郑引1号脱水蛋白表达量,并且呈正相关,说明该脱水蛋白的表达与小麦抗旱性密切相关。3、随着胁迫程度的增加,细胞膜相对透性增大,部分电解质外渗,复水后细胞膜相对透性下降,陕合6号细胞膜相对透性下降较郑引1号小,而研究表明陕合6号脱水蛋白表达量高于郑引1号,表明脱水蛋白与植物抗旱性呈正相关。4、随干旱胁迫时间的延长,陕合6号和郑引1号的可溶性蛋白含量均呈先增加后降低,复水后又有上升的趋势,脱水素也归属于可溶性蛋白,水分胁迫下陕合6号较郑引1号的可溶性蛋白含量低,其变化趋势与脱水蛋白表达趋势相反,但是陕合6号小麦抗旱性较郑引1号强,说明脱水素在组织中稳定细胞的结构起到一定的作用,体现了植物抗旱机制的复杂性,也反应了水分胁迫诱导蛋白的特点与抗脱水能力的相关性。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-12
第一章综述  12-25
  1.1 研究目的与意义  12
  1.2 脱水蛋白研究进展  12-18
    1.2.1 脱水蛋白的结构与分类  12-14
    1.2.2 脱水素的定位  14-15
    1.2.3 脱水蛋白的功能与作用机理  15-18
  1.3 蛋白定位方法研究现状  18-20
    1.3.1 融合报告基因定位法  19
    1.3.2 免疫组织化学定位法  19
    1.3.3 共分离标记酶辅助定位法  19
    1.3.4 蛋白质组学定位技术  19
    1.3.5 蛋白质组学定位技术  19-20
  1.4 胶体金免疫电镜技术研究进展  20-23
    1.4.1 胶体金免疫电镜技术的基本原理  20
    1.4.2 免疫胶体金技术的发展  20-21
    1.4.3 免疫胶体金技术的应用  21-22
    1.4.4 免疫胶体金技术的优缺点  22-23
  1.5 研究内容和技术路线  23-25
    1.5.1 研究的主要内容  23
    1.5.2 技术路线  23-25
第二章水分胁迫下小麦叶片类脱水蛋白表达的研究  25-35
  2.1 实验材料与试剂  25-26
    2.1.1 实验材料  25
    2.1.2 实验试剂  25-26
  2.2 实验方法  26-28
    2.2.1 小麦幼苗培养处理  26
    2.2.2 方法  26-28
  2.3 结果与分析  28-33
    2.3.1 蛋白定量分析  28-29
    2.3.2 水分胁迫对陕合6 号叶片类脱水素表达的影响  29-32
    2.3.3 水分胁迫下耐旱性不同两个小麦品系叶片类脱水素表达比较  32-33
  2.4 讨论与小结  33-35
第三章水分胁迫下小麦叶片类脱水蛋白亚细胞定位的研究  35-45
  3.1 实验材料与试剂仪器  35
    3.1.1 实验材料  35
    3.1.2 实验试剂与仪器  35
  3.2 实验方法  35-36
    3.2.1 小麦幼苗培养  35
    3.2.2 电镜制样  35-36
    3.2.3 免疫染色程序  36
    3.2.4 透射电镜镜检  36
    3.2.5 免疫金标记颗粒统计  36
    3.2.6 数据处理  36
  3.3 结果与分析  36-43
    3.3.1 脱水素在陕合6 号小麦叶肉细胞中的定位  36-38
    3.3.2 脱水素在郑引1 号小麦叶肉细胞中的定位  38-40
    3.3.3 水分胁迫对小麦叶片类脱水素分布的影响  40-41
    3.3.4 两个品系小麦叶片类脱水素亚细胞定位金颗粒密度比较  41-43
  3.4 讨论与小结  43-45
第四章水分胁迫下小麦叶片细胞膜透性和可溶性蛋白变化的响应  45-49
  4.1 实验材料与方法  45
    4.1.1 实验材料  45
    4.1.2 实验方法与试剂  45
  4.2 结果与分析  45-47
    4.2.1 水分胁迫对陕合6 号和郑引1 号小麦叶片细胞膜透性的影响  45-46
    4.2.2 水分胁迫对陕合6 号和郑引1 号小麦叶片可溶性总蛋白质含量的影响  46
    4.2.3 两个品系小麦叶片细胞膜相对透性和可溶性蛋白含量比较  46-47
  4.3 讨论与小结  47-49
第五章结论  49-51
参考文献  51-56
致谢  56-57
作者简介  57

水分胁迫下小麦叶片类脱水素的表达与亚细胞定位的研究

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