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单核细胞增生李斯特氏菌胶体金免疫层析方法的建立

作　者: 段霞
导　师: 赖卫华
学　校: 南昌大学
专　业: 食品科学
关键词: 单核细胞增生李斯特氏菌 多克隆抗体 单克隆抗体 胶体金免疫试纸条
分类号: TS207.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 96次
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内容摘要


单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogens, LM)是一种重要的食源性致病菌,世界卫生组织(WHO)将其列入重点检测的四大食源性致病菌之一。LM能引起人类和动物李斯特氏菌病。人和动物感染LM可引起单核细胞增多症、脑膜炎、败血症和流产,严重威胁人类健康和社会经济的发展,同时也造成巨大经济损失。因此,加强食品中LM检测工作,建立一种快速、简便的筛查方法具有重要的意义。本研究旨在建立一种简便的、特异性强的针对食品中LM的胶体金免疫试纸条检测方法。本研究分别用0.3%福尔马林灭活的LM菌体和超声波破碎的菌体碎片免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体。获得的多克隆抗体效价均达300000,与金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌有交叉反应。多克隆抗体用辛酸-硫酸铵法和磁珠吸附法纯化后纯度明显提高。以酸溶碱沉法提取的LM鞭毛蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备单克隆抗体。通过问接ELISA方法对Balb/c小鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的融合细胞培养上清进行检测,筛选到6株阳性融合细胞。但6株阳性融合细胞经过第一次亚克隆后转为阴性,最终没有筛选到能够稳定分泌单克隆抗体的融合细胞株。本研究用两株可配对的抗LM单克隆抗体,建立了特异性检测LM的胶体金免疫层析方法。抗LM单克隆抗体标记胶体金颗粒,醋酸纤维素膜上分别包被另一株抗LM单克隆抗体和驴抗鼠二抗作为检测线和控制线,组装成胶体金免疫层析试纸条。最终确定的生产工艺参数为：胶体金颗粒粒径为40 nm左右,抗LM单克隆抗体A标记量为20μg/(mL胶体金溶液),标记时pH值为8.1,检测线上抗LM单克隆抗体B浓度为2.0 mg/mL,控制线上驴抗鼠二抗浓度为1.0 mg/mL。在此工艺条件下,对LM纯培养物的检测灵敏度为107CFU/mL。对Ⅰ和4b血清型的LM均可检测,与同属的绵羊李斯特氏菌及属外的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌等菌无交叉反应。在实际食品样本添加LM,经李氏菌增菌液选择性增菌48 h后试纸条检测结果为阳性,并用OXA平板涂布计数验证结果正确。通过37℃加速保存实验,试纸条保质期可达15个月。本研究成功地研制出特异性检测LM胶体金免疫层析试纸条,该试纸条具有结果容易判定、特异性强、稳定性好、操作简单的优点,可满足基层单位大批量检测。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-11
第一章 前言  11-23
  1.1 LM的概述  11-14
    1.1.1 LM的生物学特性  11-13
    1.1.2 致病机理  13-14
    1.1.3 LM流行情况  14
  1.2 LM检测方法研究现状[7  14-18
    1.2.1 传统检测方法  14-15
    1.2.2 API Listeria快速反应板方法  15
    1.2.3 显色培养基快速检测方法  15
    1.2.4 免疫学检测方法  15-16
    1.2.5 分子生物学检测方法  16-18
  1.3 抗LM抗体研究进展  18-19
  1.4 免疫胶体金技术的概述  19-21
    1.4.1 胶体金的定义及特点  19-20
    1.4.2 胶体金的制备  20
    1.4.3 胶体金标记抗体  20
    1.4.4 胶体金免疫技术的主要模式  20-21
    1.4.5 胶体金免疫技术的应用  21
  1.5 选题的目的和意义  21-23
第二章 LM多克隆及单克隆抗体的制备  23-43
  2.1 材料与仪器  24-27
    2.1.1 试剂与材料  24-25
    2.1.2 实验仪器  25-26
    2.1.3 主要试剂的配制  26-27
  2.2 实验方法  27-34
    2.2.1 免疫原的制备  27-28
    2.2.2 多克隆抗体的制备  28-31
    2.2.3 单克隆抗体的制备  31-34
  2.3 结果  34-41
    2.3.1 LM鞭毛蛋白提取结果  34-36
    2.3.2 兔抗血清的效价  36-37
    2.3.3 兔抗血清的特异性  37-38
    2.3.4 兔抗血清的纯化  38-39
    2.3.5 小鼠抗血清效价的测定  39
    2.3.6 小鼠抗血清特异性判定  39-40
    2.3.7 阳性融合细胞的测定  40-41
    2.3.8 阳性融合细胞亚克隆的测定  41
  2.4 讨论  41
    2.4.1 多克隆抗体的制备  41
    2.4.2 单克隆抗体的制备  41
  2.5 小结  41-43
第三章 胶体金免疫层析方法的建立  43-60
  3.1 材料与仪器  43-45
    3.1.1 试剂与材料  43-45
  3.2 实验方法  45-50
    3.2.1 抗体配对实验(双抗夹心ELISA方法)  45
    3.2.2 胶体金的制备  45
    3.2.3 胶体金质量分析  45-46
    3.2.4 金标抗体的制备  46-48
    3.2.5 NC膜的处理  48
    3.2.6 LM胶体金免疫试纸条的组装  48
    3.2.7 多克隆与单克隆抗体的配对实验  48-49
    3.2.8 LM胶体金免疫试纸条评价实验  49
    3.2.9 食品样本检测  49-50
  3.3 结果  50-58
    3.3.1 抗体配对实验(ELISA方法)结果  50
    3.3.2 胶体金质量分析结果  50-51
    3.3.3 金标抗体的制备  51-54
    3.3.4 NC膜的处理  54-55
    3.3.5 LM胶体金免疫试纸条的组装  55
    3.3.6 多克隆与单克隆抗体配对实验结果  55-56
    3.3.7 LM胶体金免疫试纸条的评价  56-57
    3.3.8 食品样本的检测  57-58
  3.4 讨论  58-59
    3.4.1 胶体金的制备  58
    3.4.2 金标抗体的制备  58
    3.4.3 LM胶体金免疫试纸条的特点  58-59
  3.5 小结  59-60
第四章 结论与展望  60-62
  4.1 结论  60-61
    4.1.1 抗LM多克隆抗体的制备  60
    4.1.2 胶体金免疫层析方法的建立  60-61
  4.2 展望  61-62
    4.2.1 LM抗体的制备  61
    4.2.2 LM胶体金免疫试纸条的灵敏度  61-62
致谢  62-63
参考文献  63-67
个人介绍  67
攻读学位期间的研究成果  67

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 食品标准与检验 > 食品的微生物检验
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