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两种组分的纤维素酶基因随机突变及紫外诱变

作　者: 宗雅冬
导　师: 赵林果
学　校: 南京林业大学
专　业: 生物化工
关键词: β-葡萄糖苷酶内切葡聚糖酶易错PCR 紫外诱变表达条件酶学性质
分类号: Q933
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

为了进一步提高基因重组菌的β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶的分泌表达能力,以及为这两种酶的深入研究和开发利用提供技术指导,论文探索了β-葡萄糖苷酶和内切葡聚糖酶基因的定向进化及其基因工程菌诱变育种的可行性和方法,主要结果如下:(1)采用易错PCR技术对本实验室已克隆出的β-葡萄糖苷酶基因进行随机突变,将突变后构建的重组质粒pTRC99A-bgl1导入E.coli BL21 CodonPlus(DE3)-RIL中进行表达,结果表明,β-葡萄糖苷酶基因未能实现分泌性表达,而是形成了包涵体。(2)对酵母基因工程菌GS115-bgl1-38进行紫外诱变育种。筛选出的酵母突变株GS115-bgl1-9和GS115-bgl1-37的酶活分别为出发菌株GS115-bgl1-38产β-葡萄糖苷酶酶活的2倍和1.5倍。通过十次传代实验证明其遗传性能相对稳定。通过对GS115-bgl1-38、GS115-bgl1-9和GS115-bgl1-37的酶学性质比较可知,突变株的最适温度与出发菌株变化不大,但最适pH范围呈扩大趋势,受金属离子的影响与出发菌株差异也较大。(3)采用单因素和正交实验对酵母突变株GS115-bgl1-9分泌表达β-葡萄糖苷酶的条件进行了初步研究,适宜的条件为:接种量为4%(v/v),每24h添加0.5%(v/v)甲醇,Tween80添加量为0.2%(v/v),L-组氨酸添加量为0.5%(v/v),发酵液初始pH为5.0。(4)以内切葡聚糖酶基因为模板进行易错PCR,向内切葡聚糖酶引入突变位点,然后将PCR产物连接到载体pTRC99A上构建突变后的表达质粒pTRC99A-Cel5A,导入E.coli BL21 CodonPlus(DE3)-RIL中表达。获得透明圈明显小于未突变菌株的4个菌株pTRC99A-Cel5A-1、pTRC99A-Cel5A-2、pTRC99A-Cel5A-3和pTRC99A-Cel5A-4。4个菌株的诱导产酶实验结果表明,它们的总酶活分别为0.050 IU/mL、0.050 IU/ mL、0.048 IU/ mL、0.043 IU/ mL,均低于未突变株的表达量。但4个突变菌株的酶最适pH和最适温度有一定程度的改变。测序结果表明,突变后的Cel5A基因中少数碱基发生了改变,突变株酶学性质的改变可能就是由于这些碱基的改变所致。

全文目录

致谢  3-4
摘要  4-5
Abstract  5-9
前言  9-11
  1. 课题研究的背景及意义  9
  2. 课题研究的目的  9-10
  3. 本论文主要研究内容  10
  4. 本论文的创新点  10-11
第一章绪论  11-21
  1.1 纤维素酶的组成  11
  1.2 β-葡萄糖苷酶的概述  11-14
    1.2.1 β-葡萄糖苷酶的研究现状  11-12
    1.2.2 β-葡萄糖苷酶的应用  12-14
  1.3 中性内切葡聚糖酶的概述  14-16
    1.3.1 中性内切葡聚糖酶的研究现状  14-15
    1.3.2 内切葡聚糖酶的应用研究进展  15-16
  1.4 酶的定向进化及其筛选方法  16-18
    1.4.1 易错PCR  16-17
    1.4.2 DNA 改组  17-18
    1.4.3 酶分子定向进化的筛选策略  18
  1.5 诱变育种方法的研究进展  18-21
    1.5.1 紫外诱变  18-19
    1.5.2 化学诱变  19-21
第二章 β-葡萄糖苷酶基因的突变  21-34
  2.1 材料与方法  21-23
    2.1.1 菌株及质粒  21
    2.1.2 药品与酶  21
    2.1.3 仪器设备  21-22
    2.1.4 引物设计  22
    2.1.5 培养基及主要试剂配制  22-23
  2.2 实验方法  23-29
    2.2.1 易错PCR 条件的探索  23-24
    2.2.2 目的基因易错PCR 扩增  24
    2.2.3 PCR 扩增产物的割胶回收  24-25
    2.2.4 易错PCR 扩增产物的双酶切  25
    2.2.5 表达载体pTRC99A 的双酶切  25
    2.2.6 浓缩  25
    2.2.7 连接  25-26
    2.2.8 感受态细胞TOP10F’的制备与转化  26
    2.2.9 质粒小量提取  26-27
    2.2.10 阳性质粒的筛选  27
    2.2.11 重组菌株的筛选  27
    2.2.12 β-葡萄糖苷酶酶活测定  27-28
    2.2.13 SDS-PAGE 蛋白电泳  28-29
  2.3 结果与分析  29-32
    2.3.1 易错PCR 条件的摸索  29-30
    2.3.2 目的基因易错PCR 扩增  30
    2.3.3 目的基因 bgl1 和载体 pTRC99A 的双酶切  30-31
    2.3.4 重组质粒的提取及阳性表达质粒的筛选  31-32
    2.3.5 转化大肠杆菌表达宿主菌  32
    2.3.6 随机突变后重组菌蛋白的SDS-PAGE 电泳  32
  2.4 小结  32-34
第三章 β-葡萄糖苷酶基因工程菌的紫外诱变  34-58
  3.1 材料与方法  34-35
    3.1.1 菌株及质粒  34
    3.1.2 实验药品  34
    3.1.3 仪器设备  34
    3.1.4 培养基及主要试剂配制  34-35
  3.2 实验方法  35-42
    3.2.1 出发菌株的确立  35
    3.2.2 紫外诱变  35-37
    3.2.3 紫外诱变后菌株的筛选  37
    3.2.4 诱变后酵母突变株的传代稳定性实验  37-38
    3.2.5 诱变前后酵母酶学性质的对比  38
    3.2.6 酵母突变株 GS115-bgl1-9 产酶条件的优化  38-39
    3.2.7 酵母突变株 GS115-bgl1-9 产酶条件优化的正交试验  39-41
    3.2.8 β-葡萄糖苷酶活力测定方法  41
    3.2.9 Coomassie blue 法测定蛋白含量  41-42
  3.3 结果与分析  42-57
    3.3.1 紫外诱变出发菌株的确立  42-43
    3.3.2 紫外诱变  43-44
    3.3.3 紫外诱变后菌株的筛选  44-46
    3.3.4 紫外诱变后酵母突变菌株的遗传稳定性实验  46-47
    3.3.5 诱变前后酵母酶学性质的对比  47-51
    3.3.6 酵母突变株 GS115-bgl1-9 产酶条件的优化  51-55
    3.3.7 突变株 GS115-bgl1-9 产酶条件优化的正交试验  55-57
  3.4 小结  57-58
第四章嗜热液化芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因的突变  58-72
  4.1 材料与方法  58-59
    4.1.1 菌株及质粒  58
    4.1.2 药品与酶  58
    4.1.3 引物设计  58
    4.1.4 培养基及主要试剂配制  58-59
  4.2 试验方法  59-63
    4.2.1 不同载体及不同宿主对内切葡聚糖酶基因表达的影响  59-60
    4.2.2 内切葡聚糖酶基因的易错PCR  60
    4.2.3 琼脂糖凝胶核酸电泳及目的片段的割胶回收  60
    4.2.4 PCR 产物的双酶切  60
    4.2.5 表达载体pTRC99A 的双酶切  60-61
    4.2.6 表达质粒构建  61
    4.2.7 转化大肠杆菌表达宿主菌株  61
    4.2.8 刚果红平板法筛选  61
    4.2.9 复筛  61
    4.2.10 内切葡聚糖酶活力测定  61-63
    4.2.11 突变菌株酶学性质的研究  63
  4.3 结果与分析  63-71
    4.3.1 不同载体及不同宿主对内切葡聚糖酶基因表达的影响  63-65
    4.3.2 内切葡聚糖酶基因的易错PCR  65
    4.3.3 目的基因和载体pTRC99A 的双酶切  65
    4.3.4 表达质粒构建  65
    4.3.5 转化大肠杆菌表达宿主菌株  65-66
    4.3.6 刚果红平板法筛选  66
    4.3.7 随机突变测序结果分析  66-69
    4.3.8 突变菌株的酶学性质研究  69-71
  4.4 小结  71-72
第五章结果与讨论  72-74
  5.1 结论  72
  5.2 展望  72-74
参考文献  74-80
详细摘要  80-83

两种组分的纤维素酶基因随机突变及紫外诱变

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