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血管外膜源一氧化氮对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响及通络药物干预作用

作　者: 葛小丽
导　师: 吴以岭
学　校: 河北医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 营卫承制调平 血管外膜源NO 血管紧张素Ⅱ 血管内皮细胞 凋亡 通络药物
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:本实验以“营卫承制调平”理论为指导,结合西医学近年研究揭示的血管外膜在血管病变中发挥的重要作用,从“营气”与内膜、“卫气”与外膜相关性为切入点,通过建立内外膜共孵育细胞模型,探讨内、外膜相互影响及通络药物干预血管病变中显示的承、制、调、平规律,既是对中医营卫学说的传承,又对更全面深刻的揭示血管病变发展演变的内在机制具有指导意义。方法:1血管外膜源一氧化氮对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响1.1 AngⅡ对体外培养的血管内皮细胞活力的影响常规培养人脐静脉内皮细胞ECV-304,选择处于对数生长期融合良好的内皮细胞,经胰蛋白酶消化后调整细胞密度为1×105个/mL,接种于96孔板,待细胞融合致80%后,细胞随机分为:（1）对照组:加入无血清DMEM培养基;（2）AngⅡ组:加入终浓度分别为10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的AngⅡ。各组分别继续培养0h、6h、12h、24h、48h后,利用SRB法检测各组细胞活力的变化。1.2 AngⅡ对血管外膜源NO释放的影响选取清洁级健康雄性SD大鼠,仔细分离并截取胸主动脉,剥离外膜,并剪成2mm×2mm的组织薄片,吸干称重,用含10%FBS的DMEM培养基培养,24h后更换为无血清DMEM培养基继续培养24h,再加入终浓度为10-6mol/L的AngⅡ继续培养1h、2h、12h、24h、48h,同时设立空白对照组。硝酸还原酶法检测各组培养上清液中NO含量,免疫印迹法检测各组外膜iNOS蛋白表达水平。1.3外膜源NO对AngⅡ诱导的ECV304凋亡的影响。实验分为5组:（1）单纯内皮细胞组:孵育的ECV-304细胞,常规培养;（2）内皮细胞+外膜组:内皮细胞和外膜组织共孵育;（3）内皮细胞+AngⅡ组:孵育的内皮细胞中加入AngⅡ(终浓度为10-6mol/L)共孵育;（4）内皮细胞+外膜+AngⅡ组:于孵育的外膜中加入AngⅡ(终浓度为10-6mol/L),2h后把外膜和上清一并加入到内皮细胞中继续孵育24h;（5）内皮细胞+L-NNA+外膜+AngⅡ组:外膜与NOS阻断剂L-NNA(10-5mol/L)预孵育30min,PBS液洗涤3次,然后加入终浓度为10-6mol/L的AngⅡ预孵育,最后与内皮细胞继续孵育。实验结束后,HE染色观察血管内皮细胞形态学变化,SRB法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,硝酸还原酶法间接检测上清一氧化氮水平,western blot法检测各组细胞中eNOS蛋白表达水平2通络药物对AngⅡ诱导的外膜源一氧化氮的影响2.1通心络对血管外膜源NO释放的影响血管外膜的制备和培养同第一部分,然后分别加入终浓度为0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、500ug/ml的通心络继续培养0h、1h、2h、4h、6h、8h。实验结束后收集上清,离心后检测各组NO水平。2.2营卫调节方对血管外膜源NO释放的影响血管外膜的制备和培养同第一部分,然后分别加入终浓度为0%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%的营卫调节方继续培养0h、1h、2h、4h、6h、8h。实验结束后收集上清,离心后检测各组NO水平。2.3通络药物对AngⅡ诱导的外膜源一氧化氮的影响外膜制备和培养同第一部分,然后分为8组:（1）单纯外膜组:正常完全培养基与外膜共孵育;（2）外膜+AngⅡ:孵育的外膜中加入AngⅡ(终浓度为10-6mol/L)共孵育;（3）外膜+通心络:孵育的外膜组织中加入通心络（终浓度为50ug/ml）共孵育24h;（4）外膜+ AngⅡ+通心络:AngⅡ与外膜预孵育,2h后加入通心络继续孵育24h;（5）外膜+L-NNA+ AngⅡ+通心络:外膜与NOS阻断剂L-NNA(10-5mol/L)预孵育30min,PBS液洗涤3次,然后加入终浓度为10-6mol/L的AngⅡ预孵育,2h后加入通心络继续孵育24h;（6）外膜+营卫调节方:孵育的外膜组织中加入营卫调节方（终浓度为0.05%）共孵育;（7）外膜+ AngⅡ+营卫调节方:AngⅡ与外膜预孵育,2h后加入营卫调节方继续孵育24h;（8）外膜+L-NNA+ AngⅡ+营卫调节方组:外膜与NOS阻断剂L-NNA(10-5mol/L)预孵育30min,PBS液洗涤3次,然后加入终浓度为10-6mol/L的AngⅡ预孵育,2h后加入营卫调节方继续孵育24h。实验结束后硝酸还原酶法间接检测上清一氧化氮（NO）,western blot法检测各组中iNOS蛋白表达。结果:1血管外膜源一氧化氮对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响1.1 AngⅡ对ECV304细胞活力的影响AngⅡ可明显降低ECV304的活力,且有量效关系,与正常对照组相比,各浓度的AngⅡ均能明显引起ECV304凋亡,10-9mol/L的AngⅡOD值与正常组比较降低比较明显（P<0.05）, 10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L的AngⅡOD值降低更明显（P<0.01）;与10-9mol/L的AngⅡ相比, 10-6 mol/L的AngⅡOD值降低最为显著（P<0.001）。AngⅡ对降低ECV304活力有时间效应,与0h相比,6h、12h、24h的AngⅡOD值明显降低（P<0.01）,且随作用时间延长有降低趋势,但无统计学意义（P>0.05）。1.2不同时间点AngⅡ对外膜源NO的影响:AngⅡ诱导血管外膜培养上清中NO表达增高,并于2h时间点达到峰值,与0h比较有统计学意义（P<0.01）。1.3不同时间点AngⅡ对外膜iNOS蛋白影响: AngⅡ可以促进外膜源NO（iNOS）蛋白表达升高,于2h时间点达到峰值。1.4血管外膜源一氧化氮对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响1.4.1血管内皮细胞形态学观察单纯内皮细胞组:细胞为扁平多角形,呈铺路石样镶嵌排列,边界清楚,胞浆丰富。胞核清晰可见,为圆形或椭圆形。内皮细胞+外膜组:细胞为扁平多角形,呈铺路石样镶嵌排列,边界清楚,胞浆丰富。胞核清晰可见,为圆形或椭圆形。内皮细胞+AngⅡ组:细胞变圆、肿胀,细胞膜边缘模糊不清,部分胞膜不完整,甚至损伤破裂。内皮细胞+外膜+AngⅡ组:形状规则,细胞边界尚清楚,细胞间仍然彼此相连。内皮细胞+L-NNA外膜+AngⅡ组:细胞变圆、肿胀,细胞膜边缘模糊不清,部分胞膜不完整,甚至损伤破裂。1.4.2内皮细胞活力检测与正常对照组相比,模型组的OD值显著降低（P<0.01）;与模型组相比,外膜干预组的OD值显著升高（P<0.01）;与外膜干预组相比,L-NNA组的OD值降低明显（P<0.05）。结果提示:外膜对AngⅡ干预的内皮细胞有一定的保护作用。1.4.3内皮细胞凋亡率的检测与正常对照组相比,模型组的细胞凋亡率升高明显（P<0.05）;与模型组相比,外膜干预组的细胞凋亡率明显降低（P<0.05）,L-NNA组的细胞凋亡率无差异（P>0.05）。1.4.4各组NO水平检测与正常对照组相比,模型组的NO OD值降低明显（P<0.05）;与模型组相比,外膜干预组的NO OD值显著升高（P<0.01）;与外膜干预组相比,L-NNA组的NO OD值降低明显（P<0.05）。1.4.5各组中eNOS蛋白表达外膜对AngⅡ诱导的ECV304中eNOS蛋白表达降低具有拮抗作用;L-NNA作用外膜后,降低了外膜对内皮细胞的保护作用,从而ECV304细胞中eNOS蛋白表达降低,与外膜干预组相比有差别（P<0.05）,与模型组相比无差别（P>0.05）。2通络药物对AngⅡ诱导的外膜源一氧化氮的影响2.1通心络对外膜源NO的影响通心络可促进外膜源NO水平升高,且有量效关系,与0ug/ml相比,25ug/ml、50ug/ml的通心络均能明显促进外膜源NO的表达50ug/ml的NO OD值升高最为明显（P<0.01）。通心络对外膜源NO的影响有时间效应,从2h开始随时间延长通心络（50ug/ml）均不同程度诱导外膜培养上清中NO表达增高,并于6h时间点达到峰值,然后下降,但仍高于0h时间点。与0 h比较, 6h引起上清NO含量升高最为明显（P<0.001）。2.2营卫调节方对外膜源NO的影响营卫调节方可促进外膜源NO水平升高,且有量效关系,与0%相比,0.05%、0.01%的营卫调节方均能明显促进外膜源NO的表达,0.05%的NO OD值升高最为明显（P<0.01）。营卫调节方对外膜源NO的影响有时间效应,从1h开始随时间延长营卫调节方（0.05%）均不同程度诱导外膜培养上清中NO表达增高,并于2h时间点达到峰值,然后下降,但仍高于0h时间点。与0h比较,2h时间点引起上清NO含量升高最为明显（P<0.001）。2.3通络药物对AngⅡ诱导的外膜源一氧化氮的影响2.3.1各组NO表达水平的变化与单纯外膜组相比,AngⅡ组、通心络组、营卫调节方组的NO OD值均能明显升高（P<0.01）;与AngⅡ组和通心络组相比,TXL+AngⅡ组的NO OD值显著升高（P<0.01）;使用阻断剂后（TXL+ AngⅡ+L-NNA）NO OD值明显降低,与TXL+AngⅡ相比有显著差别（P<0.01）;YWTJF+AngⅡ组与TXL+AngⅡ组相比有差别（P<0.05） ,表明通心络的作用优于营卫调节方。2.3.2各组外膜组织中iNOS蛋白表达与单纯外膜组相比,AngⅡ、通心络、营卫调节方均能促进外膜iNOS表达（P<0.01）;在TXL+AngⅡ的共同作用下,iNOS的表达高于单一因素作用, L-NNA作用外膜后,外膜的iNOS表达明显降低,与TXL+AngⅡ相比有显著差别（P<0.01）;与AngⅡ、通心络组相比,有降低趋势,但无统计学意义。通心络和营卫调节方均能促进外膜iNOS表达,且通心络的作用优于营卫调节方。结论:1本研究以“营卫承制调平”理论为指导,基于“营行脉中”、“卫行脉外”,营卫以血脉为界相偕而行,共同调节着脉络舒缩功能及血液运行的重要功能,结合西医学揭示的血管外膜与内皮在血管病变中发挥的重要作用,指出营气与血管内皮、卫气与血管外膜具有高度相关性,这对于从外膜与内皮之间相互影响探讨“脉络-血管系统病”发病机制,揭示“营卫承制调平”理论在血管病变防治中的科学价值具有重要理论指导作用。2基于营气与内皮、卫气与外膜相关性,本研究以外膜与内皮细胞共孵育建立体外模型,探讨外膜对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响,结果显示血管外膜可通过激活NOS/NO途径抑制AngⅡ引起的内皮细胞凋亡,不仅初步揭示了外膜在血管病变发生中的作用,也为探讨中医营卫失和对“脉络-血管系统病”的影响提供了实验数据支持。3以络病理论为指导的通心络和基于营卫学说指导血管病变研制的营卫调节方均能通过提高AngⅡ作用下外膜NO水平、增强iNOS蛋白表达保护血管内皮,且通心络作用优于营卫调节方,其机制与调节外膜NOS/NO系统有关。4本实验结果提示:AngⅡ可使内皮细胞损伤,NO分泌减少;加入外膜组织后,NO的分泌代偿性增加,能够拮抗AngⅡ引起的内皮损伤;通络药物干预使外膜源NO的分泌明显增加,从而保护内皮细胞。这体现了在内外膜共孵育体系中“营卫承制调平”的演变规律,也对运用“营卫承制调平”理论指导血管病变提供了实验数据支持。

全文目录


中文摘要  5-11
英文摘要  11-19
英文缩写  19-20
研究论文 血管外膜源一氧化氮对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响及通络药物的干预作用  20-75
  引言  20-23
  第一部分 “营卫承制调平”指导心脑血管病防治研究的理论探讨  23-31
    参考文献  29-31
  第二部分 血管外膜源一氧化氮对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响  31-59
    前言  31
    实验一 AngⅡ对内皮细胞活力的影响  31-37
      材料与方法  31-34
      结果  34-35
      附图  35-36
      附表  36-37
    实验二 AngⅡ对外膜源NO 的影响  37-43
      材料与方法  37-40
      结果  40-41
      附图  41-42
      附表  42-43
    实验三 血管外膜源一氧化氮对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响  43-53
      材料与方法  43-46
      结果  46-48
      附图  48-51
      附表  51-53
    讨论  53-56
    参考文献  56-59
  第三部分通络药物对AngⅡ诱导的外膜源一氧化氮的影响  59-74
    前言  59
    材料与方法  59-62
    结果  62-64
    附图  64-67
    附表  67-70
    讨论  70-72
    参考文献  72-74
  结论  74-75
综述一 浅述营卫  75-81
综述二 血管外膜在血管病变中作用的研究进展  81-88
致谢  88-89
个人简历  89

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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