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多头带绦虫四川株六钩蚴Tm45W基因的克隆与原核表达

作　者: 牟静
导　师: 杨光友
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 多头带绦虫六钩蚴 Tm45W基因原核表达 BALB/c小鼠体液免疫
分类号: S852.734
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

脑多头蚴病是由多头带绦虫的幼虫寄生于家畜所引起的疾病,该病是一种动物传染性疾病,人也有感染,但相对较少。该病给全世界许多地区的养羊业造成了巨大的经济损失。目前对该病的防治主要是以药物为主,但是随着分子生物学技术的不断发展,疫苗防制将会成为最具有前景的方法之一。为了进行抗脑多头蚴病疫苗的研究,本试验参照GenBank中收录的羊带绦虫、猪带绦虫和牛带绦虫报道的保护性抗原基因45W的核苷酸序列设计了1对引物,并用该引物对六钩蚴的总RNA进行RT-PCR扩增,得到813bp的目的基因片段。胶回收试剂盒回收目的片段并克隆到PMD18-T载体上,序列测定结果显示,本次实验成功克隆得到了多头带绦虫六钩蚴Tm45W保护性抗原基因,其ORF为765bp,编码255个氨基酸的多肽,预测分子量为27.623 kDa,等电点理论值为5.08,具有较强的亲水性。该序列已登录到GenBank(登录号为FJ514241)。软件分析表明多头带绦虫四川株六钩蚴Tm45W基因与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因部分序列的同源性最高为90.60%,与牛带绦虫的45W基因序列同源性为87.24%,与羊带绦虫序列的同源性为84.05%,与猪带绦虫序列的同源性最低为78.17%。将目的片断插入pET32a(+)表达载体上,并将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.4mM／L的IPTG诱导成功表达了多头带绦虫Tm45W基因,SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约45kDa处有明显的蛋白质表达条带,该蛋白在8h时基本达到表达量最大值,而不同IPTG浓度之间没有明显表达差异,均都得到了很好的表达。同时采用脑包虫病患羊血清为一抗进行免疫印迹反应,结果发现重组载体菌表达产物可与患病羊阳性血清反应出现蛋白免疫印迹带,由此说明表达的蛋白质具有其抗原性。将30只小鼠随机分成对照组(FCA组、PBS组)与重组蛋白疫苗免疫组,每组10只,’第一组皮下分点注射重组蛋白(pET-32a(+)-Tm45W)和弗氏完全佐剂混合液,第二组皮下分点注射弗氏完全佐剂,第三组皮下注射PBS液(pH 7.5),以上三组注射液均以0.1mL／只的剂量注射且连续接种三次,每次接种时间间隔14d。各组小鼠在首次免疫后0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及42 d断尾采血,置4℃过夜,5000 r/min离心10 min,收集血清,-20℃保存备用。ELISA检测小鼠血清中的抗体结果显示：免疫组与对照组差异极显著(P<0.01),FCA组与PBS组差异不显著(P>0.05)；IgG与IgGl之间的水平差异不显著(P>0.05),IgG/IgG1与IgG2a之间的水平差异显著(P<0.05)；免疫组、FCA组和PBS组三组之间的IgM/IgE抗体水平差异不显著(P>0.05)。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章文献综述  10-23
  1.动物脑多头蚴病的研究进展  10-17
    1.1 流行病学  10-11
    1.2 生物学  11
      1.2.1 虫卵的生物学特性  11
      1.2.2 脑多头蚴细胞系  11
    1.3 致病作用与临床症状  11-12
    1.4 病理变化  12-13
    1.5 免疫学  13-14
      1.5.1 抗原成份分析  13
      1.5.2 不同抗原成份免疫原性  13-14
    1.6 分子生物学  14-16
      1.6.1 分子分类  14
      1.6.2 抗原基因  14-16
    1.7 诊断与防治  16-17
  2.带科绦虫45W基因的研究进展  17-22
    2.1 45W基因的来源  17
    2.2 45W基因的结构及特征  17-19
    2.3 带科绦虫45W蛋白  19
    2.4 带科绦虫45W疫苗及其免疫应答特点  19-22
    2.5 展望  22
  3.实验目的和意义  22-23
第二章多头带绦虫六钩蚴基因Tm45W的克隆与原核表达  23-58
  1.材料与方法  23-37
    1.1 试验材料  23-26
      1.1.1 试验样品  23
      1.1.2 主要试剂  23
      1.1.3 菌株及质粒载体  23
      1.1.4 主要仪器设备  23-24
      1.1.5 培养基和常用溶液的配制  24-26
      1.1.6 主要生物信息学数据库和计算机软件  26
    1.2 试验方法  26-37
      1.2.1 多头带绦虫六钩蚴的孵化与激活  26
      1.2.2 多头带绦虫六钩蚴基因Tm45W的克隆  26-29
      1.2.3 多头带绦虫六钩蚴基因Tm45W的原核表达载体构建  29-32
      1.2.4 重组pET-32a(+)-Tm45W质粒在大肠杆菌中的诱导表达  32-36
      1.2.5 重组pET-32a(+)-Tm45W质粒表达产物的免疫原性分析  36-37
  2.试验结果  37-54
    2.1 多带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆  37-43
      2.1.1 六钩蚴Tm45W基因的PCR扩增  37-38
      2.1.2 重组克隆质粒的PCR鉴定  38
      2.1.3 重组克隆质粒的序列鉴定  38
      2.1.4 重组克隆质粒的序列分析  38-40
      2.1.5 Tm45W基因片断的蛋白质生物信息学分析  40-43
    2.2 Tm45W基因的亚克隆  43-44
      2.2.1 加酶切位点引物的PCR扩增  43
      2.2.2 重组质粒的PCR与酶切鉴定  43-44
    2.3 Tm45W基因重组表达质粒的构建与鉴定  44-45
      2.3.1 重组表达质粒的双酶切鉴定  44-45
      2.3.2 重组表达质粒的序列鉴定  45
    2.4 重组表达质粒的诱导表达  45-46
    2.5 重组质粒表达条件的优化  46-48
      2.5.1 IPTG浓度的优化  46
      2.5.2 诱导时间的优化  46-47
      2.5.3 诱导温度的优化  47-48
    2.6 重组表达蛋白可溶性分析  48
    2.7 融合蛋白表达产物Western-Blotting检测  48-49
    2.8 免疫前后小鼠血清抗体的ELISA检测结果  49-54
      2.8.1 小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a的检测结果  49-52
      2.8.2 小鼠血清中IgM和IgE的检测结果  52-54
  3.讨论  54-58
    3.1 关于多头带绦虫六钩蚴总RNA的抽提  54
    3.2 Tm45W基因的扩增  54-55
    3.3 Tm45W基因在原核表达系统pET-32a(+)中的表达  55
    3.4 包涵体的形成及纯化  55-56
    3.5 表达产物的小鼠免疫及其抗体的检测  56-58
第三章结论与创新点  58-59
  1 结论  58
  2 创新点  58-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
攻读学位期间发表的学术论文  67

多头带绦虫四川株六钩蚴Tm45W基因的克隆与原核表达

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