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猪干扰素刺激基因ISG20的克隆、真核表达及其对PRRSV增殖的影响

作　者: 李燕
导　师: 陈焕春
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: ISG20 克隆进化树分析结构预测真核表达 PRRSV增殖
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

干扰素(Interferon, IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和增强免疫功能的细胞因子,其抗病毒作用是通过诱导一系列干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)表达产生抗病毒蛋白而实现的。ISG20基因是新近发现的一种表达20kDa蛋白的干扰素刺激基因,表达产物具有核酸外切酶活性,能降解单链RNA及DNA,研究证实在同时敲除PKR、2’,5’-OAS及Mx三个基因的小鼠成纤维母细胞中表达ISG20能抑制水疱性口炎病毒(VSV)的增殖,说明ISG20参与介导IFN的抗病毒作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是一种单股正链RNA病毒,引起猪的繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),给世界养猪业造成了巨大的经济损失。寻找有效的抗病毒基因将为抗PRRSV品系的培育和PRRS的有效预防控制创造条件,为此本研究以猪干扰素刺激基因ISG20为研究对象,对其在PRRSV增殖中的作用进行了初步探讨。主要研究内容如下：1.猪ISG20的克隆、序列分析及其进化树的绘制以PK-15细胞的cDNA为模板,RT-RCR扩增获得猪ISG20的编码区序列,序列分析发现该基因全长为516bp,可编码171个氨基酸残基,与GenBank上所报道的猪ISG20氨基酸序列同源性为99%,与牛、狗、人、类人猿、猴、马、小鼠、大鼠的氨基酸序列同源性分别为：91%、84%、80%、80%、78%、76%、73%、72%。系统进化树分析表明：不同物种ISG20之间的氨基酸序列同源性很高,说明ISG20在进化中是高度保守的。2.猪ISG20结构预测与功能分析通过蛋白质结构预测,发现猪ISG20在6-171位氨基酸之间有3个Asp(D)残基、1个Glu(E)残基和一个核酸外切酶功能域,说明猪ISG20属于DEDD核酸外切酶超家族。此外,在猪ISG20蛋白中,含45.03%的α-螺旋,24.56%的β-折叠和30.43%的无规则卷曲,这一比例符合α／β折叠蛋白的二级结构比例。以人ISG20的三级结构为模板,同源建模猪ISG20相应区段的三级结构,发现猪ISG20与人ISG20的相应结构域非常相似,这提示它的生物学功能可能与人ISG20相似。3.猪ISG20的真核表达及其亚细胞定位分析构建了野生型猪及核酸外切酶活性功能缺失突变型ISG20的真核表达质粒,Western blot分析证实两种质粒均能有效表达ISG20。将野生型猪ISG20基因插入pEGFP-C1下游获得ISG20与EGFP融合的真核表达质粒,转染细胞后,经激光共聚焦显微镜检测,发现猪ISG20主要位于细胞核,在细胞浆内只有少量的分布。4.猪ISG20对PRRSV增殖的影响运用绝对定量及TCID50分析,发现表达的野生型猪ISG20对PRRSV的增殖有显著的抑制作用,而表达无核酸外切酶活性的突变型猪ISG20对PRRSV的增殖无影响,说明猪ISG20对PRRSV的抑制作用依赖其核酸外切酶活性。5. PRRSV感染对猪ISG20基因表达的影响以PRRSV感染SJPL细胞,相对定量RT-PCR分析PRRSV感染对猪ISG20基因表达的影响,发现PRRSV感染SJPL细胞能显著诱导猪ISG20基因的表达,因此,我们推测宿主本身的ISG20可能在PRRSV感染过程中有一定的防御作用。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表(Abbreviation)  10-12
第1章文献综述  12-19
  1.1 猪繁殖与呼吸综合征  12
  1.2 PRRS的危害及流行病学特点  12
  1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒的特性  12-13
  1.4 猪感染PRRSV后的免疫学反应  13-14
  1.5 干扰素刺激基因  14-19
    1.5.1 干扰素介导并发挥作用的JAK-STAT信号转导通路  15-16
    1.5.2 干扰素诱导的几种重要的干扰素刺激基因  16-19
      1.5.2.1 双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)  17
      1.5.2.2 2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)  17
      1.5.2.3 粘病毒抗性基因(Mx)  17
      1.5.2.4 干扰素刺激基因20(ISG20)  17-19
第2章研究目的与意义  19-20
第3章材料与方法  20-33
  3.1 试验材料  20-24
    3.1.1 毒株、细胞与菌株  20
    3.1.2 载体与质粒  20-21
    3.1.3 工具酶及主要试剂  21-22
    3.1.4 培养基与抗生素及其配制  22
    3.1.5 抗体  22
    3.1.6 主要缓冲液与相关试剂及其配制  22-24
    3.1.7 分子生物学分析软件  24
  3.2 试验方法  24-33
    3.2.1 PRRSV的增殖  24
    3.2.2 限制性内切酶酶切反应  24
    3.2.3 PCR产物或酶切产物的电泳检测  24
    3.2.4 PCR产物或酶切产物的回收与纯化  24-25
    3.2.5 外源DNA片段与目的载体的连接反应  25
    3.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  25
    3.2.7 连接产物的转化  25-26
    3.2.8 质粒的制备与鉴定  26-27
    3.2.9 质粒转染(脂质体介导转染法)  27-28
    3.2.10 Western blot检测目的蛋白在真核细胞中的表达  28-29
    3.2.11 半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定  29
    3.2.12 DAPI染色  29-30
    3.2.13 细胞、感染病毒的细胞样品总RNA的提取  30
    3.2.14 cDNA的合成  30-31
    3.2.15 SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测细胞中ISG20的mRNA含量  31
    3.2.16 相对mRNA表达水平的计算  31
    3.2.17 绝对荧光定量检测SJPL细胞中PRRSV的含量  31-32
    3.2.18 猪ISG20二级结构及三级结构预测  32
    3.2.19 统计学方法  32-33
第4章结果和分析  33-45
  4.1 猪ISG20的克隆、序列分析及进化树的绘制  33-38
    4.1.1 野生型猪ISG20基因的RT-PCR扩增与克隆  33-34
    4.1.2 突变型猪ISG20基因的RT-PCR扩增与克隆  34-36
    4.1.3 猪ISG20的序列分析  36-38
    4.1.4 系统发育树分析  38
  4.2 猪ISG20结构预测与功能分析  38-40
    4.2.1 二级结构预测  38-39
    4.2.2 三级结构预测  39-40
  4.3 猪ISG20的真核表达及其亚细胞定位分析  40-42
    4.3.1 猪ISG20与EGFP融合的真核表达质粒构建  40-41
    4.3.2 猪ISG20的真核表达及Western blot鉴定分析  41
    4.3.3 猪ISG20的亚细胞定位分析  41-42
  4.4 猪ISG20对PRRSV增殖的影响  42-43
    4.4.1 Real-Time PCR检测猪ISG20对PRRSV增殖的影响  42
    4.4.2 TCID_(50)检测猪ISG20对PRRSV增殖的影响  42-43
  4.5 PRRSV感染对猪ISG20基因表达的影响  43-45
第5章讨论与结论  45-49
  5.1 讨论  45-48
    5.1.1 猪ISG20的克隆、序列分析及其进化树的绘制  45-46
    5.1.2 猪ISG20结构预测与功能分析  46
    5.1.3 猪ISG20的真核表达及其亚细胞定位分析  46-47
    5.1.4 猪ISG20对PRRSV增殖的影响  47-48
    5.1.5 PRRSV感染对猪ISG20基因表达的影响  48
  5.2 结论  48-49
参考文献  49-54
致谢  54

猪干扰素刺激基因ISG20的克隆、真核表达及其对PRRSV增殖的影响

内容摘要

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