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鲢IL-8、TNF、CXCR1、CXCR2和HSP70基因的克隆与分析

作　者: 童芳
导　师: 林小涛
学　校: 暨南大学
专　业: 水生生物学
关键词: 鲢 IL-8 TNF CXCR1 CXCR2 HSP70 克隆进化树分析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)属于鲤形目，鲤科，鲢亚科，在淡水养殖业中占有重要的经济地位。目前对鲢的基础免疫学研究报道较少，为了探讨鲢的免疫防御机理，我们采用RT-PCR和RACE-PCR技术，克隆了鲢免疫相关因子IL-8全长cDNA序列，TNF、CXCR1、CXCR2和HSP70 cDNA核心片段，并推测得到其相应氨基酸序列。同时将得到的氨基酸序列分别与其它动物相应的氨基酸序列进行同源性比较，并通过MEGA4软件以邻接法构建系统进化树，从分子生物学角度研究鲢与其它动物的亲缘远近关系。序列分析结果表明，鲢IL-8 cDNA全序列长679bp，开放阅读框长297bp，编码98个氨基酸，含有CXC亚家族标签序列和ELR特征序列；鲢TNF cDNA核心片段长860bp，编码153个氨基酸，包含一个TNF家族标签序列、TNF2家族分布文件、构成二硫键的两个保守半胱氨酸和两个TNF-a基因特有的内毒素应答序列(TTATTTAT)；鲢CXCR1 cDNA核心片段646bp，编码55个氨基酸；鲢CXCR2 cDNA核心片段481bp，编码150个氨基酸；鲢HSP70 cDNA核心片段长988bp，编码329个氨基酸，含有一个HSP70家族标签序列。进化分析结果表明，鲢IL-8处于鱼类CXCa型分枝中，为CXCa型趋化因子，与鲤形目鲤鱼(Cyprinus carpio)进化亲缘关系最近，与鲑形目虹鳟(Oncorhynchus mykiss)IL-8具有较近的进化亲缘关系，而与鲽形目褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)，鲀形目红鳍东方鲀(Takifugu Rubripes)，鳕形目黑线鳕(Melanogrammus Aeglefinus)、大西洋鳕(Gadus morhua)具有较远的进化亲缘关系；鲢TNF为a型TNF，与鲤形目鲤鱼亲缘关系最近，与鲶形目斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)亲缘关系较近，而与鲽形目褐牙鲆，鲈型目金头鯛(Sparus aurata)、真鲷(Pagrus major)关系较远；鲢HSP70与鲤形目鲤鱼、金鱼、斑马鱼亲缘关系最近，而与鲀形目红鳍东方鲀、鲈形目舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)、黄锡鯛(Rhabdosargus sarba)、鲽形目牙鲆亲缘关系较远。RT-PCR结果表明鲢IL-8主要在胰、肝脏和头肾中表达，肠和鳃中有少量表达，而在肌肉和脑中几乎没有表达。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-10
第一章前言  10-25
  1 细胞因子、细胞因子受体及热休克蛋白概述  10-16
    1.1 细胞因子  10-14
    1.2 细胞因子受体  14-15
    1.3 热休克蛋白  15-16
  2 白细胞介素-8  16-18
    2.1 IL-8概述  16-17
    2.2 IL-8的生物学功能  17-18
  3 肿瘤坏死因子  18-20
    3.1 TNF概述  18-19
    3.2 TNF-a的生物学功能  19-20
  4 IL-8受体家族  20-21
    4.1 CXCR1  20-21
    4.2 CXCR2  21
  5 热休克蛋白70  21-23
    5.1 HSP70概述  21
    5.2 HSP70的生物学功能  21-23
  6 研究背景、意义和内容  23-25
    6.1 研究背景  23
    6.2 研究意义  23-24
    6.3 研究对象  24
    6.4 研究内容  24
    6.5 研究思路  24-25
第二章材料与方法  25-38
  1 材料  25
    1.1 实验材料  25
  2 实验方法  25-38
    2.1 鲢IL-8、TNF、CXCR1、CXCR2和HSP70基因核心片段的克隆  25-31
    2.2 鲢IL-8、TNF与CXCR1基因cDNA 3′末端的克隆  31-34
    2.3 鲢IL-8 cDNA 5′末端的克隆  34-36
    2.4 序列分析与进化树的建立  36
    2.5 RT-PCR分析  36-38
第三章结果与讨论  38-65
  1 鲢头肾与肝脏组织总RNA的提取  38
  2 鲢IL-8、CXCR1、CXCR2、TNF与HSP70基因cDNA核心片段的克隆  38-40
    2.1 RT-PCR扩增鲢IL-8、CXCR1、CXCR2、TNF与HSP70基因核心片段  38-39
    2.2 PCR产物T载体克隆和序列测定  39-40
  3 鲢IL-8、TNF与CXCR1基因cDNA 3′末端的克隆  40-42
    3.1 3′-RACE扩增鲢IL-8、TNF与CXCR1基因cDNA 3′末端  40-41
    3.2 PCR产物T载体克隆和序列测定  41-42
  4 鲢IL-8基因cDNA 5′末端的克隆  42-43
  5 鲢IL-8与其它动物IL-8同源性比较及系统进化分析  43-50
    5.1 鲢IL-8基因cDNA全序列分析  43-44
    5.2 鲢IL-8氨基酸序列的同源性分析及系统进化树的建立  44-50
  6 鲢TNF与其它动物TNF同源性比较及系统进化分析  50-55
    6.1 鲢TNF基因cDNA核心序列分析  50-51
    6.2 鲢TNF氨基酸序列的同源性分析及系统进化树的建立  51-55
  7 鲢HSP70与其它动物HSP70同源性比较及系统进化分析  55-62
    7.1 鲢HSP70基因cDNA核心序列分析  55-57
    7.2 鲢HSP70氨基酸序列的同源性分析及系统进化树的建立  57-62
  8 鲢CXCR1基因核心序列分析  62-63
  9 鲢CXCR2基因核心序列分析  63
  10 鲢IL-8组成型表达分析  63-65
结论  65-66
参考文献  66-74
附录一缩略词表  74-76
附录二常用试剂与缓冲液的配置  76-78
附录三 3′-RACE原理图  78-79
附录四 5′-RACE原理图  79-80
在学期间发表论文情况  80-81
致谢  81

鲢IL-8、TNF、CXCR1、CXCR2和HSP70基因的克隆与分析

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