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依普拉芬对体外鸡胚小肠上皮细胞新型钙离子通道表达的影响

作　者: 王磊
导　师: 侯加法
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 鸡胚 小肠上皮细胞 依普拉芬 新型钙离子通道 表达
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


试验I、鸡胚小肠上皮细胞培养与鉴定目的：培养鸡胚小肠上皮细胞。方法：从18日龄鸡胚中取一段十二指肠段,用组织块培养法和以50μg·mL-1嗜热菌蛋白酶与0.2μg·mL-1胶原酶I型联合消化获取的肠隐窝,在37.5℃、5% CO2的条件下,用含5%胎牛血清的完全培养基培养小肠上皮细胞。用差速消化法和差速贴壁法,进一步纯化、传代。采用形态学观察、Giemsa染色和免疫化学染色法进行小肠上皮细胞鉴定。结果：组织块培养法和酶联合消化培养法都可以得到鸡胚小肠上皮细胞,纯化后纯度理想。结论：鸡胚小肠上皮细胞培养成功,培养的细胞纯度理想,为下一步研究提供了实验材料。试验Ⅱ、依普拉芬对鸡胚小肠上皮细胞生长的影响目的：在建立鸡胚小肠上皮细胞体外培养方法的基础上,研究依普拉芬对鸡胚小肠上皮细胞增殖、分化和代谢功能的影响。方法：取生长状态良好的第二代小肠上皮细胞接种于96孔板,添加含1%FBS的DMEM对照组和含不同浓度的依普拉芬实验组,72 h后分别用MTT法、PNPP法测定小肠上皮细胞增殖率和小肠上皮细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性。结果：(1)与对照组相比,10-6 mol·L-1,10-7 mol·L-1和10-8 mol·L-的依普拉芬均显著促进小肠上皮细胞增殖(P<0.01); 10-5mol·L-1依普拉芬显著抑制小肠上皮细胞的增殖(P<0.01)；(2)与对照组相比,10-6 mol·L-1、10-7 mol·L-1和10-8 mol·L-1依普拉芬极显著促进小肠上皮细胞ALP活性(P<0.01),10-9mol·L-1显著促进小肠上皮细胞ALP活性(P<0.05); 10-5mol·L-1(?)勺依普拉芬显著抑制小肠上皮细胞内ALP活性(P<0.01)。结论：依普拉芬能显著促进小肠上皮细胞的增殖；使小肠上皮细胞内的ALP显著增加；但依普拉芬浓度越大,其上皮细胞则呈现明显的抑制作用。试验Ⅲ、依普拉芬对鸡胚小肠上皮细胞钙离子通道基因表达的影响目的：在建立鸡胚小肠上皮细胞体外培养方法的基础上,研究TRPV6在小肠上皮细胞上表达的定位以及依普拉芬对TRPV6、CaBP-D28k和PMCA1b mRNA表达的影响。方法：免疫细胞化学方法研究TRPV6表达定位；用含10-6mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8mol·L-1、10-9mol·L-1和10-10mol·L-1不同浓度的依普拉芬以及含1% FBS的DMEM对照组处理第二代鸡胚小肠上皮细胞72 h后,用RT-PCR方法检测其TRPV6、CaBP-D28k和PMCA1b mRNA表达量变化。结果：(1) TRPV6表达定位于鸡胚小肠上皮细胞胞膜上；(2)与对照组相比,10-6 mol·L-1,10-7 mo·L-1、10-8 mol·L-1依普拉芬显著上调PMCA1b和CaBP-D28k mRNA的表达(P<0.01),10-9 mol·L-1依普拉芬作用下TRPV6的表达出现明显上升(P<0.05),10-6 mol·L-1、10-7mol·L-1、10-8 mol·L-1依普拉芬能够显著上调TRPV6 mRNA表达(P<0.01)。结论：鸡胚小肠上皮细胞胞膜上存在TRPV6表达；依普拉芬能显著上调小肠上皮细胞TRPV6、CaBP-D28k和PMCA1b mRNA表达量。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-12缩略语  12-13前言  13-15上篇 文献综述  15-39  第一章 钙吸收和转运蛋白的研究进展  15-30    1 肠钙离子吸收和转运机制  15    2 钙离子跨细胞吸收和转运相关蛋白  15-23      2.1 钙离子通道TRPV5/TRPV6  15-19      2.2 钙结合蛋白CaBP-D28k/CaBP-D9k  19-21      2.3 钙泵  21-23    3 展望  23-24    参考文献  24-30  第二章 肠上皮细胞培养及应用  30-39    1 肠上皮细胞结构和组成  30-31    2 肠上皮细胞培养  31-34      2.1 肠上皮细胞分离  31-32      2.2 肠上皮细胞纯化  32-33      2.3 培养环境  33-34      2.4 肠上皮细胞鉴定  34    3 肠上皮细胞应用  34-35    4 展望  35-36    参考文献  36-39下篇 试验研究  39-79  第三章 鸡胚小肠上皮细胞培养与鉴定  39-56    1 材料  40-41      1.1 试验动物  40      1.2 主要仪器器材  40      1.3 主要试剂  40-41    2 方法  41-43      2.1 培养板或培养瓶的鼠尾胶原包被  41      2.2 组织块原代培养方法  41      2.3 酶消化原代培养方法  41-42      2.4 小肠上皮细胞传代  42      2.5 鸡胚小肠上皮细胞鉴定  42-43      2.6 小肠上皮细胞生长曲线  43    3 结果  43-49      3.1 肠隐窝分离效果  43-44      3.2 小肠上皮细胞生长状态、形态观察  44-47      3.3 免疫细胞化学鉴定结果  47-48      3.4 MTT法测定细胞的增殖情况  48-49    4 讨论  49-52      4.1 肠上皮细胞来源  49      4.2 肠上皮细胞分离方法  49-50      4.3 肠上皮细胞纯化方法  50      4.4 肠上皮细胞培养环境  50-51      4.5 肠上皮细胞的鉴定  51-52    5 小结  52-53    参考文献  53-56  第四章 依普拉芬对鸡胚小肠上皮细胞生长的影响  56-64    1 材料  57      1.1 试验动物  57      1.2 主要仪器器材  57      1.3 主要试剂  57    2 方法  57-58      2.1 细胞培养  57      2.2 细胞鉴定  57      2.3 试验分组  57      2.4 依普拉芬对小肠上皮细胞功能的影响  57-58    3 结果  58-61      3.1 细胞鉴定  58-59      3.2 依普拉芬对鸡胚小肠上皮细胞增值率的影响  59-60      3.3 依普拉芬对鸡胚小肠上皮细胞内碱性磷酸酶(ALP)影响  60-61    4 讨论  61    5 小结  61-62    参考文献  62-64  第五章 依普拉芬对鸡胚小肠上皮细胞钙离子通道基因表达的影响  64-79    1 材料  65      1.1 试验动物  65      1.2 主要仪器器材  65      1.3 主要试剂  65    2 方法  65-69      2.1 小肠上皮细胞培养及鉴定  65      2.2 小肠上皮细胞上TRPV6蛋白表达  65-66      2.3 依普拉芬对小肠上皮细胞的处理  66      2.4 RT-PCR  66-69    3 结果  69-72      3.1 鸡胚小肠上皮细胞TRPV6免疫细胞化学检测结果  69      3.2 RT-PCR结果  69-72    4 讨论  72-74    5 小结  74-75    参考文献  75-79全文总结  79-81论文创新之处  81-83附录  83-87致谢  87

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家禽 > 鸡
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