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新疆哈萨克族食管癌survivin基因的克隆及其siRNA干扰研究

作　者: 刘佑斌
导　师: 李惠武
学　校: 新疆医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: survivin基因哈萨克族食管癌凋亡食管癌细胞
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:survivin主要表达于细胞周期的G2/M期。它不仅具有抑制凋亡、调控细胞周期、而且还与血管形成、肿瘤的浸润、转移、耐药和放疗抗拒等有关。目前研究表明,它与新疆哈萨克族食管癌的发病有着密切的联系,我们从哈萨克族食管癌中克隆出survivin基因,为进一步研究它在新疆哈萨克族食管癌发生发展中的作用奠定基础。并购买survivin特异性siRNA真核表达载体,为以survivin基因为靶点、小片段干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)为手段的食管癌和其它恶性肿瘤的基因治疗打下基础。通过转染食管癌细胞株Eca109,用流式细胞仪检测survivin基因对食管癌细胞凋亡的影响、用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测相关基因表达的情况,以便研究survivin基因在新疆哈萨克族食管癌中的作用机制。方法:①PCR技术自人哈萨克族食管癌cDNA中克隆survivin基因。②将所获片段与真核表达载体pEGFP-N1连接后转入大肠杆菌DH5α中,通过EcoRI与BamH1双酶切鉴定和测序鉴定。③survivin基因siRNA真核表达载体,用Lipofectamine TM2000(脂质体转染试剂)转染入食管癌细胞株Eca109中。④用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,通过流式细胞仪检测食管癌细胞株Eca-109的凋亡参数,用RT-PCR和Western blot检测相关基因表达的情况。结果:①DNA测序证明获得了包含ORF全长的survivin基因,并成功克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,同时有可能发现了新的变异体。②在荧光显微镜下可观察到食管癌细胞株Eca109中有绿色荧光蛋白,证明survivin- pEGFP-N1转染成功。③转染有survivin基因siRNA的食管癌细胞株Eca109的凋亡率明显增高;survivin基因、c-myc基因、PTEN基因、cyclinD1基因在转录水平表达下降;survivin基因在蛋白水平表达下降。结论:①新疆哈萨克族食管癌中survivin基因真核表达载体构建成功。②经荧光显微镜检测到survivin- pEGFP-N1转染入食管癌细胞株Eca-109中。③survivin基因siRNA真核表达载体干扰有效。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-10
前言  10-12
材料与方法  12-22
  1. 材料  12-14
  2. 方法  14-22
结果  22-30
  1.新疆哈萨克族食管癌中 survivin 基因真核表达载体的构建  22-25
  2.survivin 基因的转染以及干扰后的研究  25-30
讨论  30-33
小结  33-34
致谢  34-35
参考文献  35-38
综述  38-51
攻读硕士学位期间发表的学术论文  51-52
导师评阅表  52

新疆哈萨克族食管癌survivin基因的克隆及其siRNA干扰研究

内容摘要

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