学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

猪戊型肝炎DNA疫苗的构建及免疫效果的初步研究

作　者: 赵慧
导　师: 华修国
学　校: 上海交通大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪戊型肝炎 ORF3 DNA疫苗免疫
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 23次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的:构建猪戊型肝炎病毒ORF3基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)/ORF3,并在COS-7细胞中进行表达。通过肌肉注射与IL-2联合免疫Balb/C小鼠,检测其产生的免疫应答水平,以期望通过基因疫苗作用使小鼠对戊肝病毒产生免疫防御能力。方法:用PRIMER5.0软件设计引物,PCR扩增ORF3全基因,将PCR产物纯化后插入pcDNA3.1(+)载体,将重组质粒pcDNA3.1(+)/ORF3转化入感受态细胞DH5α进行大量复制。转染COS-7细胞,用免疫细胞化学和Westenrn-Blot验证其在真核细胞得到表达后,将重组质粒pcDNA3.1(+)/ORF3、对照空质粒pcDNA3.1(+)及生理盐水分组通过肌肉注射免疫6周龄Balb/C雌鼠,隔两周免疫一次,共免疫3次,第二周加白介素2辅佐免疫。初免后每隔2周采用ELISA间接法测定小鼠血清中抗ORF3 IgM抗体水平。通过PCR法检测小鼠肌细胞中ORF3基因的存在。结果:成功克隆了ORF3基因,构建了pcDNA3.1(+)/ORF3重组真核表达载体,重组质粒能在COS-7细胞内有效表达目的蛋白。小鼠接种pcDNA3.1(+)/ORP3核酸疫苗后能产生特异性IgM抗体。PCR检测ORF3基因可在小鼠肌细胞中存在。结论:(1)成功克隆了猪戊型肝炎病毒ORF3基因。(2)成功构建了pcDNA3.1(+)/ORF3真核表达载体且其能在真核细胞中表达。(3) pcDNA3.1(+)/ORF3核酸疫苗在小鼠体内可诱导产生免疫应答。(4) pcDNA3.1(+)/ORF3核酸疫苗接种Balb/C小鼠后能在肌细胞中存在。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
符号说明  10-11
一、引言  11-30
  1.1 戊型肝炎病毒的研究进展  11-27
    1.1.1 HE 病原学  11-12
    1.1.2 HEV 基因分型  12-13
    1.1.3 HEV 的基因组结构  13-16
      1.1.3.1 ORF1-非结构蛋白编码区  13-14
      1.1.3.2 ORF2-结构蛋白编码区  14-16
      1.1.3.3 ORF3-蛋白编码区  16
    1.1.4 HEV 的地理分布  16-17
    1.1.5 HEV 作为人畜共患病的传染特性  17-19
    1.1.6 HEV 的细胞培养  19-20
    1.1.7 HE 的临床特征  20-21
    1.1.8 HE 的发病机理  21-22
    1.1.9 HEV 的检测方法  22-27
  1.2 DNA 疫苗简介  27
  1.3 戊肝DNA 疫苗靶点的选择  27-28
  1.4 问题与展望  28-29
  1.5 本研究的目的和意义  29-30
二、实验材料  30-33
  2.1 主要仪器设备及材料  30-31
    2.1.1 主要实验仪器  30
    2.1.2 菌株、载体和细胞株  30-31
  2.2 主要实验试剂  31-33
    2.2.1 试剂盒  31
    2.2.2 酶类  31
    2.2.3 抗体  31
    2.2.4 抗生素  31
    2.2.5 实验动物  31-32
    2.2.6 其他  32-33
三、实验方法及步骤  33-44
  第一部分重组真核表达载体pcDNA3.1（+）/ORF3 的构建、鉴定及其表达  33-42
    1.1 ORF3 真核表达载体的构建  33-38
      1.1.1 引物的设计与合成  33-34
      1.1.2 PCR 方法扩增戊型肝炎病毒（HEV）ORF3 部分基因  34
      1.1.3 PCR 产物初步鉴定  34
      1.1.4 PCR 产物的纯化与回收  34-35
      1.1.5 载体PCDNA3.1(+)质粒的准备  35
      1.1.6 用限制性内切酶双酶切质粒pcDNA3.1(+)及目的片段ORF3基因  35-36
      1.1.7 ORF3 目的片段与载体质粒的连接反应  36-37
      1.1.8 感受态细菌DH5-α购自天根公司  37
      1.1.9 pcDNA3.1(+)/ORF3 质粒的转化和筛选  37-38
    1.2 pcDNA3.1(+)/ORF3 真核表达载体的鉴定  38-39
      1.2.1 pcDNA3.1(+)/ORF3 的双酶切鉴定  38
      1.2.2 pcDNA3.1(+)/ORF3 的PCR 鉴定  38-39
      1.2.3 测序鉴定  39
    1.3. pcDNA3.1(+)/ORF3 真核表达重组体在Cos-7 细胞中的表达  39-41
      1.3.1 无内毒素pcDNA3.1/ORF3 重组质粒的大量制备  39-40
      1.3.2 pcDNA3.1(+)/ORF3 重组质粒转染Cos-7 细胞  40-41
    1.4. pcDNA3.1(+)/ORF3 重组质粒在Cos-7 细胞中的表达鉴定  41-42
      1.4.1 免疫细胞化学观察ORF3 基因在Cos-7 细胞中的表达  41
      1.4.2 免疫印迹检测转染细胞中表达的ORF3 蛋白  41-42
  第二部分 pcDNA3.1(+)/ORF3 核酸疫苗在小鼠体内免疫活性的研究  42-44
    2.1 pcDNA3.1(+)/ORF3 重组质粒核酸疫苗的制备及纯化  42
    2.2 pcDNA3.1(+)/ORF3 核酸疫苗的免疫接种  42
    2.3 pcDNA3.1(+)/ORF3 核酸疫苗的免疫活性评价  42-44
      2.3.1 体液免疫水平检测  42-43
      2.3.2 PCR 法检测ORF3 基因在小鼠肌细胞内的存在  43-44
四、实验结果  44-54
  第一部分ORF3 真核表达载体的构建、鉴定及表达  44-49
    1.1 pcDNA3.1(+)/ORF3 真核表达载体的构建及鉴定  44-46
      1.1.1 ORF3 基因的PCR 扩增  44
      1.1.2 pcDNA3.1(+)空质粒摇菌提纯结果  44-45
      1.1.3 pcDNA3.1(+)/ORF3 重组质粒的酶切及PCR 鉴定  45
      1.1.4 测序鉴定  45-46
    1.2 pcDNA3.1(+)/ORF3 在Cos-7 细胞中的表达  46-49
      1.2.1 免疫荧光细胞化学鉴定  46-47
      1.2.2 Western-blot 鉴定  47-49
  第二部分 pcDNA3.1(+)/ORF3 核酸疫苗在 Balb/C 小鼠中免疫活性的研究结果  49-54
    2.1 血清特异性抗体的检测  49-52
    2.2 PCR 检测ORF3 基因在小鼠肌细胞中存在  52-54
五、讨论  54-58
六、结论  58-59
参考文献  59-65
致谢  65-66
攻读学位期间发表的学术论文  66

猪戊型肝炎DNA疫苗的构建及免疫效果的初步研究

内容摘要

全文目录

相似论文