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AWP1与整合素α_v的相互作用及其生物学功能研究

作　者: 李旭艳
导　师: 姜勇
学　校: 第一军医大学
专　业: 病理生理学
关键词: 整合素α_v 胞内功能域 AWP1 蛋白质-蛋白质相互作用凋亡
分类号: R341
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

蛋白激酶C相关激酶（protein kinase C related kinase，PRK）与蛋白激酶C相似，最初PRKs被确定为蛋白酶激活的丝／苏氨酸激酶，并且被命名为蛋白酶活激酶（protease-activated kianse，PAK）。PRK的羧基端结构域有50％与蛋白激酶C的羧基端结构域同源，因此被称为PRK。而PRK氨基端的结构域是独特的，与蛋白激酶C的不同，这可能是PRK与蛋白激酶C能够分别被不同的脂质激活的原因。PRK能够被磷脂尤其是心磷脂（cardiolipin）激活，但是不能被Ca²⁺、甘油二酯（diacylglyerol）、佛波酯（phobol ester）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine）激活。蛋白激酶C相关激酶1（protein kinase C related kinase 1，PRK1）是PRKs家族最具特色的成员，它能够通过氨基端与GTP结合蛋白RhoA结合，并以GTP依赖模式被激活。PRK1能够与不同的细胞分子相关或相互作用，主要是结构蛋白如：波形蛋白（vimentin），神经胶质纤酸蛋白，α-肌动蛋白（α-actin）以及神经丝蛋白（neurofilament protein）等。已有报道证实，PRK1在凋亡过程中具有特殊的作用。PRK1相关蛋白（associated with PRK1，AWP1），是用人CDC34作诱饵，利用酵母双杂交系统鉴定出来的一个与CDC34相互作用的蛋白质。它能够在哺乳动物细胞中与PRK1发生免疫共沉淀。AWP1是一个全新的蛋白质，全长cDNA序列中拥有一个627bp的开放阅读框，分子量大小为22.56kD。AWP1广泛存在于多种组织中，在人与鼠胚胎发育的早期就已经出现。深入探讨AWP1在人及鼠早期胚胎发育过程中的作用具有重要意义。AWP1能够通过调节PRK1的亚细胞定位参与复杂的细胞信号网络，在信号转导通路中担当一个信号分子的角色。分析AWP1的氨基酸序列可以发现其两端各有一个锌指结构域。其中，人AWP1氨基端保守的锌指结构域A20位于11-35位氨基酸，羧基端保守的锌指结构域AN1位于149-189位氨基酸。一直以来，锌指结构域都被认为参与DNA结合并在转录因子中存在。最近有研究发现，锌指结构域也能够参与蛋白与蛋白的相互作用。A20蛋白能够被大量的免疫刺激因素诱导，是凋亡的抑制剂。它的锌指结构域能够与蛋白激酶C相连。因此，AWP1的锌指结构域A20极有可能参与蛋白-蛋白的相互作用。同时，AWP1也是强烈的NF-κB抑制剂，由此可见，AWP1可能在哺乳动物信号转导通路中起到重要调控的作用。从AWP1的发现和它的蛋白功能结构域分析可以看出，AWP1具有与多种蛋白分子相互作用的潜能。整合素是细胞表面受体的一个大家族，它是由非共价键联结α亚基和β亚基组成的异二聚体。α_v亚基是整合素家族独特的成员之一，能与至少5种不同的β亚基相联结，参与细胞迁移、增殖、分化和基因转录等，尤其在肿瘤恶性转移和新生血管形成中具有特殊作用。整合素的胞内结构域在整合素介导的细胞功能中具有重要作用。整合素通过胞内结构域与细胞骨架、信号分子及其他的细胞内蛋白相互作用，介导双向跨膜的生理功能。近年来的大量研究证明，细胞内的很多蛋白能够与整合素胞内功能域直接作用，这种相互作用在整合素调控的生物反应中具有重要作用。整合素在细胞黏附、迁移、分化、增殖及细胞程序性死亡中具有重要作用。我们前期利用整合素α亚基胞浆内段作为“饵”，利用酵母双杂交系统鉴定到了一个与其相互作用的阳性克隆——AWP1蛋白。蛋白质氨基酸序列以及cDNA核苷酸序列的计算机比较分析显示，整合素α_v亚基胞内结构域与CDC34序列极其相似。既然AWP1与CDC34、PRK1之间具有相互作用，那么它与整合素α_v亚基胞内结构域是否也存在相互作用呢?在前期的离体结合研究中我们已经证实，AWP1蛋白在体外能够与整合素α_v亚基胞内结构域特异性结合，并且这种作用与α_v，亚基胞内结构域Y⁹⁸⁶酪氨酸残基的作用密切相关。既然两者的相互作用在体外状态下存在，那么在体内这种相互作用仍有可能存在。这个问题在阐明两者的生理功能中有着相当重要的意义。利用基因重组技术构建缺乏Y⁹⁸⁶氨基酸的α_v亚基胞内结构域（α_v-C）及含有Y⁹⁸⁶氨基酸的α_v亚基胞内结构域（α_v-CY）的pEGFP-C2融合蛋白表达载体，并在HEK293细胞中表达，观察其在细胞内的表达与定位。构建pEGFP-C2／AWP，pcDNA3／HA-α_v及pcDNA3／HA-α_v（Y986F）表达质粒，其中α_v（Y986F）是将野生型α_v的Y⁹⁸⁶突变为苯丙氨酸（F）。将pEGFP-C2／AWP1分别与pcDNA3／HA-α_v、pcDNA3／HA-α_v（Y986F）共转染ECV304细胞，用免疫荧光共定位法检测两者在细胞内的定位。结果发现，当与pcDNA3／HA-α_v（Y986F）共转染细胞时，GFP-AWP1融合蛋白弥散分布于细胞中。而与pcDNA3／HA-α_v共转染细胞时，GFP-AWP1融合蛋白定位于细胞浆近膜侧。这提示两者在哺乳动物细胞中存在相互作用。并且Y⁹⁸⁶酪氨酸残基在两者的相互作用中具有重要作用。将pEGFP-C2／AWP1质粒转染ECV304细胞，发现GFP-AWP1融合蛋白弥散分布于细胞质中。如果以纤连蛋白Fn（fibronectin，Fn）对细胞进行刺激，则GFP-AWP1融合蛋白主要定位于细胞浆近膜侧。采用两步克隆的方法将整合素α_v、突变型α_v（Y986F）及人AWP1编码序列分别构建入带有增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）标签的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，采用化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，得到重组腺病毒载体，并转染人胚肾细胞HEK293A，包装成重组病毒颗粒。为进一步研究α_v及AWP1的功能提供了重要的实验材料。同时发现，α_v过表达能够明显增强人肝癌细胞SMMC-7721的黏附能力。AWP1过表达则能够促进人肝癌细胞SMMC-7721细胞及血管内皮细胞ECV304的增殖，暗示AWP1可能是凋亡的抑制剂，并且它的抑制作用可能与锌指结构域A20的功能有关。通过上述研究，初步得出以下结论：1．AWP1可能与α_v有相互作用，这种相互作用与Y⁹⁸⁶的作用有关。2．α_v过表达能够明显增强人肝癌细胞SMMC-7721的黏附能力。3．AWP1过表达能够促进SMMC-7721、ECV304细胞的增殖，提示AWP1可能是凋亡的抑制剂。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-12
第一章前言  12-15
第二章材料和方法  15-26
  2.1 材料  15-18
    2.1.1 主要试剂  15
    2.1.2 试剂配制  15-17
    2.1.3 质粒、菌株和细胞株  17
    2.1.4 主要仪器  17-18
  2.2 方法  18-26
    2.2.1 整合素α_v胞内结构域融合蛋白表达载体的构建及表达  18-21
    2.2.2 pcDNA3／HA-α_v及pcDNA3／HA-α_v(Y986F)表达载体的构建  21-22
    2.2.3 pEGFP-C2／AWP1融合基因载体的构建及其表达、移位  22
    2.2.4 HA-α_v及HA-α_v(Y986F)与GFP-AWP1免疫荧光检测  22-23
    2.2.5 整合素α_v及其突变体重组腺病毒的制备  23-24
    2.2.6 整合素α_v对SMMC-7721细胞黏附的影响  24
    2.2.7 人AWP1重组腺病毒的制备  24-25
    2.2.8 人AWP1对细胞增殖的影响  25-26
第三章结果  26-39
  3.1 整合素α_v胞内结构域融合蛋白表达载体的构建及表达  26-29
  3.2 pcDNA3／HA-α_v及pcDNA3／HA-α_v(Y986F)表达载体的构建  29-31
  3.3 pEGFP-C2／AWP1融合基因载体的构建及其表达、移位  31-32
  3.4 HA-α_v及HA-α_v(Y986F)与GFP-AWP1免疫荧光检测  32-33
  3.5 整合素α_v及其突变体重组腺病毒的制备  33-35
  3.6 整合素α_v对SMMC-7721细胞黏附的影响  35-36
  3.7 人AWP1重组腺病毒的制备  36-37
  3.8 人AWP1对细胞增殖的影响  37-39
第四章讨论  39-45
第五章小结  45-46
参考文献  46-49
附录  49-63
  附录1 (英文缩略词表)  49-51
  附录2 (综述)  51-63
发表论文情况  63-64
致谢  64-65

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