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放线菌FL-2菌种鉴定及其活性代谢产物分离纯化研究

作　者: 杨智超
导　师: 刘党生
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 放线菌 分类鉴定 发酵条件 分离纯化
分类号: R915
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


本论文以从土壤中分离得到的放线菌株FL-2为研究对象。首先对其进行纯化,通过自然选育的方法,得到抑菌活性相对较强的菌落形态,并对其斜面培养基进行筛选,获得较优斜面培养基为：玉米面5g,麦芽糖5g,酵母膏4g,琼脂20g,水1000ml, pH7.0-7.2。用此培养基进行传代培养表明,该菌株传代稳定性良好。采用经典鉴定方法和分子分类方法对菌种FL-2进行了鉴定,结果表明,放线菌FL-2属于链霉菌属,并且与娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)具有99%的同源性,FL-2菌株的形态及培养特征与Streptomyces rochei基本一致但略有不同,生理生化测定也有差异,所以确定菌株FL-2是链霉菌属Streptomyces rochei的一个变种。本文还对菌株的发酵条件进行了优化,通过正交试验设计,确定了优化的发酵培养基配方为：玉米粉50g, MgSO40.5g, KCl2.5g, KH2PO43g, Na2HPO4 1g,水1000ml。优化发酵条件组合为：发酵时间6d,初始pH值7.0,装液量50ml,发酵温度28℃,摇床转速220r/min。对菌株FL-2发酵产物的热稳定性和酸碱稳定性进行了测定。结果表明,pH值为6.4时,该菌株发酵产物在60℃水浴温度下稳定性较好,处理一小时后发现对葱菌核病菌的抑制率只下降了11.13%。100℃水浴温度下活性随时间延长变化较大,处理一小时后发现对葱菌核病菌的抑制率下降了58.31%。同时研究结果显示,产物在中性、偏碱条件下稳定性较好,在强酸条件下活性降低较快。常温下储藏二个月表明该菌株产物稳定性较高。发酵液经预处理、溶媒萃取等步骤后,采用薄层层析色谱对活性物质进行分离制备。收集活性组分,利用高效液相色谱对分离产品进行进一步的分析和纯化,色谱条件为：流动相0.02mol/L磷酸二氢钾：乙腈(60:40),流速1ml/min,检测波长207nm,活性成分实现良好的分离,高效液相制备出的单组分可以满足光谱分析等进一步研究的需要。经ESI-MS得出此活性纯品的分子量为463。

全文目录


摘要  9-10
ABSTRACT  10-11
第一章 前言  11-20
  1.1 生物农药  11-13
  1.2 农用抗生素  13-15
    1.2.1 农用抗生素的研究概况  13-14
    1.2.2 农用抗生素的抗菌作用机理  14-15
  1.3 抗生素的分离纯化  15-18
    1.3.1 过滤和离心  15
    1.3.2 溶媒萃取  15
    1.3.3 沉淀和重结晶  15-16
    1.3.4 吸附法  16
    1.3.5 色谱分离法  16-17
    1.3.6 其他分离方法  17-18
  1.4 农用抗生素产生菌—放线菌的分类地位的研究  18
  1.5 论文研究思路及内容  18-20
第二章 材料与方法  20-33
  2.1 实验材料  20-23
    2.1.1 菌种  20
    2.1.2 试剂和材料  20-21
    2.1.3 培养基  21-23
    2.1.4 仪器和设备  23
  2.2 实验方法  23-33
    2.2.1 目的菌株的纯化  23-26
    2.2.2 菌株FL-2的分类鉴定  26-28
    2.2.3 菌株FL-2发酵条件优化  28
    2.2.4 发酵液稳定性研究  28-29
    2.2.5 放线菌FL-2代谢产物的分离与精制  29-33
第三章 结果与分析  33-52
  3.1 目的菌株的纯化  33-35
    3.1.1 菌株的纯化  33
    3.1.2 斜面培养基的选择  33-35
  3.2 菌株FL-2的分类鉴定  35-39
    3.2.1 16SrDNA序列测定结果  35-37
    3.2.2 菌株FL-2的形态学观察  37
    3.2.3 菌株FL-2培养特征和生理生化特征  37-38
    3.2.4 鉴定结论  38-39
  3.3 菌株FL-2发酵条件优化  39-42
    3.3.1 发酵培养基的选择  39-40
    3.3.2 发酵温度的优化  40
    3.3.3 发酵培养条件优化  40-41
    3.3.4 发酵培养基的优化  41-42
    3.3.5 发酵条件的优化结果  42
  3.4 发酵液稳定性研究  42-43
    3.4.1 发酵液的热稳定性研究  42
    3.4.2 发酵液对酸碱的稳定性  42-43
  3.5 放线菌FL-2代谢产物的分离与精制  43-52
    3.5.1 极性和酸碱性测定  43-46
    3.5.2 发酵液的预处理  46
    3.5.3 发酵上清的液液萃取  46-47
    3.5.4 薄层层析试验  47-48
    3.5.5 高效液相色谱分析结果  48-51
    3.5.6 活性组分ESI-MS测定结果  51-52
第四章 结论  52-55
参考文献  55-58
致谢  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物生物学
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