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呋喃丹半抗原合成与多克隆抗体制备及其检测应用

作　者: 朱德锐
导　师: 刘德立
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 呋喃丹人工抗原多克隆抗体间接竞争ELISA 试剂盒应用检测
分类号: S481.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

呋喃丹（Carbofuran,2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯）,学名克百威,自1969年由FMC公司和Mobay化学公司开发生产后即作为一种高效、广谱的杀虫剂,广泛应用于粮食、蔬菜和水果等的害虫防治。呋喃丹能与体内的胆碱酯酶不可逆结合,从而抑制其活性,使乙酰胆碱在组织中蓄积而引起中毒。在土壤中残留呋喃丹不易降解,半衰期较长,其降解产物3-羟基呋喃丹的毒性高于呋喃丹,易造成环境污染。国家农药残留标准中已规定其在粮食和蔬菜中不得检出,但违禁使用现象仍较严重,给果蔬农产品出口经济带来严重损失。因此,建立快速、灵敏的检测方法,对加强食品安全监测,保护环境具有重要意义。本研究以呋喃丹、对硝基苯氯甲酸酯和6-氨基己酸为反应原料,避免传统的三光气化学合成工艺,合成呋喃丹半抗原:6-[[（2,3-二氢-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基氧）羰基]氨基]己酸（BFNH）。将半抗原与载体蛋白（BSA、OVA）偶联制备了呋喃丹人工免疫抗原BSA-BFNH和包被抗原OVA-BFNH。利用BFNH-BSA免疫家兔获得抗呋喃丹多克隆抗体,并通过间接ELISA法测定抗体效价。结果表明家兔抗血清效价达到1.28×10⁶。根据方阵滴定筛选抗原抗体最佳工作浓度,当OD₄₅₀在1.0左右时,包被抗原浓度为0.25μg·mL^-1,一抗稀释倍数为1:1.6×10⁵,羊抗兔IgG-HRP稀释1:10⁴倍,以此作为本实验的最佳工作浓度。采用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,纯化抗体效价达到1.024×10⁷,浓缩后抗体的蛋白浓度为40mg·mL^-1,经10%SDS-PAGE分析,重、轻链分子量分别约为55kDa和22kDa。通过间接竞争ELISA测定不同浓度的标准呋喃丹抑制率,制作呋喃丹标准曲线,利用软件Origin7.5进行线性回归分析。在10^-7～0.01mg·mL^-1范围内,抑制率与标准农药浓度的线性关系显著,y=27.13+3.54X（R=0.9971）,最低检测限为10^-7mg·mL^-1,与5种结构相似的氨基甲酸酯类的交叉反应率低于10%。开发出的快速检测呋喃丹残留ELISA试剂盒应用于茭头样品中呋喃丹残留的快速检测,表明适用于大批量样品快速初筛。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1. 前言  10-24
  1.1 农药使用现状和残留危害  10-11
  1.2 氨基甲酸酯类农药  11-12
  1.3 呋喃丹及残留毒性  12-13
  1.4 氨基甲酸酯类农药残留样品前处理技术  13-14
  1.5 氨基甲酸酯类农药残留量分析方法  14-17
    1.5.1 仪器分析方法  14-15
    1.5.2 生物检测方法  15-16
    1.5.3 免疫分析方法  16
    1.5.4 生物传感器法  16-17
    1.5.5 荧光分析检测  17
  1.6 农药人工抗原的设计合成与抗体的制备  17-20
    1.6.1 半抗原的设计  18
    1.6.2 半抗原的合成  18-19
    1.6.3 载体的选择  19
    1.6.4 人工抗原和酶标农药抗原的合成  19-20
    1.6.5 抗农药抗体的制备  20
  1.7 ELISA在农药残留检测中的应用  20-23
    1.7.1 ELISA的基本原理  20
    1.7.2 ELISA的测定方法  20-21
    1.7.3 ELISA广泛应用  21-22
    1.7.4 ELISA在农药残检中存在问题和应用前景  22-23
  1.8 研究目的和意义  23-24
2. 材料与方法  24-33
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 主要试剂  24
    2.1.2 仪器  24-25
    2.1.3 缓冲液  25
    2.1.4 检测样品来源  25
  2.2 实验方法  25-33
    2.2.1 呋喃丹半抗原的设计  25-26
    2.2.2 呋喃丹半抗原的合成  26-27
    2.2.3 人工抗原的制备  27-28
    2.2.4 动物免疫和抗血清的采集  28-29
    2.2.5 最佳工作浓度的确定  29
    2.2.6 血清效价检测  29
    2.2.7 抗血清的纯化  29-30
    2.2.8 抗体特异性测定  30
    2.2.9 ELISA试剂盒的初步开发研究  30-33
3. 结果与分析  33-49
  3.1 半抗原分子设计与化学合成分析  33-35
    3.1.1 半抗原分子设计  33
    3.1.2 呋喃酚和中间产物的鉴定分析  33-34
    3.1.3 半抗原BFNH合成鉴定分析  34-35
  3.2 半抗原与蛋白质偶联和鉴定  35-37
    3.2.1 紫外扫描鉴定  35-36
    3.2.2 BFNH-BSA红外光谱鉴定  36-37
  3.3 效价检测时抗原抗体工作浓度筛选  37
  3.4 活体采血前抗血清效价测定  37-38
  3.5 兔II抗体纯化质量鉴定  38-39
  3.6 抗原抗体最佳工作条件测定  39
  3.7 抗体特异性鉴定  39-41
  3.8 制定呋喃丹标准浓度曲线  41
  3.9 初步开发呋喃丹ELISA试剂盒  41-44
    3.9.1 试剂盒的基本原理  41
    3.9.2 检测试剂盒的组成和储存  41-42
    3.9.3 实验设备器材  42
    3.9.4 试剂盒操作步骤说明  42
    3.9.5 数据分析  42-43
    3.9.6 试剂盒精密度测定  43
    3.9.7 试剂盒准确度测定  43-44
  3.10 茭头样品测定应用  44-49
4. 讨论  49-51
附录  51-52
参考文献  52-58
硕士期间发表的论文  58-59
致谢  59

呋喃丹半抗原合成与多克隆抗体制备及其检测应用

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