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hnRNP A2/B1在脑缺血再灌注损伤中的表达研究

作　者: 吴艳
导　师: 张成岗；范礼斌
学　校: 安徽医科大学
专　业: 细胞生物学
关键词: hnRNP A2 B1 氧糖剥夺 缺血再灌注 易位 亚硫酸钠 多克隆抗体
分类号: R743
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的在PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞)中建立局部脑梗塞的氧糖剥夺模型(OGD, Oxygen and glucose deprivation),并利用该模型研究heterogeneous nuclear ribonulcleoprotein A2/B1 (hnRNP A2/B1)在氧与糖的刺激下是否发生易位现象；为确定缺血(大脑中动脉阻塞模型,MCAO)再灌注后发生易位的是hnRNP A2和/或hnRNP B1变异体,制备其各自的多克隆抗体,并且可用于后续对hnRNP A2和hnRNP B1作用机制的研究。方法根据文献数据重建OGD模型；按照常规细胞培养方法,制备PC12细胞不同时间(5min、10min、15min、30min、45min、1h、3h、6h、12h、24h、48h)持续性氧糖剥夺模型,采用MTT法检测细胞的存活率,以评估持续性氧糖剥夺对PC12细胞的损伤作用。继而进行氧、血清和葡萄糖三种因素分别交叉缺失5min后的损伤效应研究,同样采用MTT法分析细胞的存活率。利用所建立的氧糖剥夺模型进行持续性的氧糖剥夺和拆分后的单纯缺氧、单纯无糖处理PC12细胞再恢复培养后,通过免疫细胞化学和免疫荧光化学的方法,检测hnRNP A2/B1在PC12细胞或神经元中的定位。以亚硫酸钠浓度分别为0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L、5.0g/L,代替物理缺氧进行氧糖剥夺处理PC12细胞4h、6h后,用MTT法检测细胞存活率,再与物理缺氧组比较,并将亚硫酸钠作为替代物理缺氧的化学试剂来处理细胞,同样在恢复培养后通过免疫荧光化学的方法检测hnRNP A2/B1在PC12细胞中的定位。利用目前成熟的多克隆抗体制备技术,以合成的hnRNP A2和hnRNP B1各自特异性的寡肽偶联上载体蛋白KLH后作为抗原免疫新西兰大白兔,经过多次免疫后获得的抗血清对大鼠缺血再灌注24h的大脑皮层进行免疫组化鉴定。结果PC12细胞在持续性氧糖剥夺模型条件下的半数存活时间为10.3min,进而发现低氧和缺乏血清对细胞存活率影响不大,而培养基中葡萄糖浓度对细胞的存活率影响较大,且呈一定的浓度相关性。持续性氧糖剥夺24h时hnRNP A2/B1有明显向核周聚集、且在细胞核区域呈现空缺的现象,而在其他的持续性氧糖剥夺实验和拆分氧、糖单独处理组再恢复培养后,免疫细胞化学和免疫荧光化学实验中,均未发现hnRNP A2/B1发生核突易位的现象。使用亚硫酸钠来替代物理缺氧的实验中,通过与物理缺氧后细胞存活率的比较,细胞存活趋势一致,且亚硫酸钠5g/L处理细胞与氧剥夺处理细胞时的OGD结果较接近,因此使用此浓度替代物理缺氧进行持续性氧糖剥夺24h时,hnRNP A2/B1出现轻微地向核周聚集的现象。通过hnRNP A2和hnRNP B1各自特异性的寡肽偶联载体蛋白KLH后,免疫新西兰大白兔获得的抗血清在1：500的稀释比例下,可以得到较清晰的hnRNP在缺血再灌注24h的大脑皮层中定位的图片。结论成功建立PC12 OGD模型,在建立持续性氧糖剥夺模型的基础上确定了PC12细胞的半数存活时间,并且明确了氧、血清和葡萄糖对细胞存活率的影响,hnRNPA2/B1主要定位于细胞核区域,在氧糖剥夺持续24h时明显向核周聚集。为揭示局部脑缺血低氧损伤相关疾病的机理、救治因缺血导致的中风提供了重要参考资料。

全文目录


英文缩写索引  6-8
中文摘要  8-9
Abstract  9-12
前言  12-14
第一部分 细胞氧糖剥夺模型建立  14-21
  材料  14-16
  方法  16
  结果  16-20
  讨论  20-21
第二部分 hnRNP A2/B1在细胞中定位与表达  21-40
  材料  21-23
  方法  23-29
  结果  29-39
  讨论  39-40
第三部分 hnRNP A2和hnRNP B1各自多克隆抗体的制备  40-52
  材料  41-42
  方法  42-48
  结果  48-51
  讨论  51-52
结论  52-54
参考文献  54-57
附录  57-59
  简历  57
  教育背景  57
  专业技能  57-58
  英语及计算机水平  58
  发表论文  58
  致谢  58-59
综述 突起中的RNA结合蛋白  59-67
  参考文献  64-67

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中图分类: > 医药、卫生 > 神经病学与精神病学 > 神经病学 > 脑血管疾病
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