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板栗疫病菌RNA干扰系统的建立

作　者: 蓝瑛
导　师: 陈保善
学　校: 广西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: RNA干扰 pFCNH-intron 板栗疫病菌
分类号: S436.64
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 39次
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内容摘要


对本实验室前期构建的一个可在板栗疫病菌中自主复制的穿梭质粒pFC9进行优化，通过改造多克隆位点和增加内含子序列，得到一个由板栗疫病菌gpd启动子与终止子控制的、多克隆位点之间带有内含子序列的RNA干扰表达载体pFCNH-intron。用该载体构建板栗疫病菌漆酶基因(lac-1)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的RNA干扰质粒，并进行RNA干扰效率测定。荧光定量PCR分析表明，50％的lac-1 RNA干扰株中目的基因表达量明显降低，最高的干扰程度达到了80％；60％的GFP RNA干扰株目的基因表达量明显降低，最高干扰程度达到60％。板栗疫病菌RNA干扰系统的建立为板栗疫病菌基因功能研究奠定了基础。

全文目录


摘要  2-3
ABSTRACT  3-7
第一章 前言  7-20
  1 板栗疫病菌与低毒病毒  7-12
    1.1 板栗疫病与板栗疫病菌  7
    1.2 板栗疫病菌中的低毒力现象  7-8
    1.3 低毒病毒  8-9
    1.4 板栗疫病菌与低毒病毒相互作用研究  9-12
      1.4.1 低毒力相关的蛋白酶  9-10
      1.4.2 G蛋白信号传导对真菌毒力的影响  10-11
      1.4.3 肌醇三磷酸(IP3)/Ca2+/钙调蛋白信号传导途径对真菌毒力的影响  11
      1.4.4 板栗疫病菌cDNA芯片在研究低毒病毒/板栗疫病菌相互作用上的应用  11-12
  2 RNA沉默及其在真菌研究中的应用  12-19
    2.1 RNA沉默的发现  12-13
    2.2 RNA沉默的分子机制  13-14
    2.3 真菌中的RNA沉默现象  14-16
      2.3.1 Quelling  14-15
      2.3.2 MSUD  15-16
    2.4 RNA沉默在真菌研究中的优势和不足  16-17
    2.5 RNA沉默在真菌中的应用  17-18
    2.6 RNA沉默在丝状真菌基因功能研究中的应用  18-19
  3 课题研究目的和意义  19-20
第二章 材料和方法  20-36
  1 菌种  20
    1.1 细菌菌种  20
    1.2 真菌菌种  20
    1.3 质粒  20
  2 培养基及培养条件  20-22
    2.1 大肠杆菌培养基  20-21
      2.1.1 LB培养基  20-21
      2.1.2 LA培养基  21
    2.2 板栗疫病菌培养基  21-22
      2.2.1 PDA培养基  21
      2.2.2 EP完全培养基  21-22
    2.3 菌株培养条件  22
  3 抗生素及其使用浓度  22
  4 质粒DNA的提取  22-24
    4.1 质粒DNA的小规模提取  22-23
    4.2 质粒DNA的大量提取  23-24
    4.3 溶液中蛋白质及RNA的去除  24
  5 DNA的酶切  24-25
  6 DNA片段的回收  25
  7 DNA的连接反应  25
  8 质粒DNA的转化  25-27
    8.1 甘油法制备E.coli的感受态细胞  25-26
    8.2 氯化铷法制备大肠杆菌感受态细胞  26
    8.3 质粒DNA的电脉冲转化  26
    8.4 质粒DNA的热击转化  26-27
  9 PCR反应  27
    9.1 PCR反应体系  27
    9.2 PCR反应条件  27
  10 真菌原生质体的制备  27-29
  11 真菌原生质体转化  29
  12 丝状真菌总DNA的提取  29-30
  13 丝状真菌总RNA的提取  30-31
  14 荧光定量PCR  31-33
    14.1 引物设计  31-32
    14.2 cDNA第一链的合成  32
    14.3 荧光定量PCR  32-33
  15 Southern杂交  33-36
    15.1 向下毛细管转移法进行Southern印迹  33-34
    15.2 DNA印迹的杂交分析  34-36
      15.2.1 预杂交  34-35
      15.2.2 探针标记  35
      15.2.3 洗膜  35-36
第三章 结果与分析  36-56
  1 RNA干扰载体的构建以及验证  36-45
    1.1 RNA干扰载体的构建  36-37
    1.2 板栗疫病菌漆酶基因(lac-1)的RNA干扰  37-45
      1.2.1 含发夹结构lac-1 RNA干扰质粒的构建  38-42
        1.2.1.1 lac-1融合片断和内含子序列的获得  38-39
        1.2.1.2 融合PCR连接lac-1 RNA干扰片断和内含子  39-41
        1.2.1.3 pFC-lac(+)质粒的构建  41
        1.2.1.4 lac-1 RNA干扰质粒pFC-lac(+/-)的构建  41-42
      1.2.2 EP155漆酶基因(lac-1)的RNA干扰  42-45
        1.2.2.1 阳性转化子的PCR检测  43
        1.2.2.2 lac-1 RNA干扰株漆酶表达量的观察  43-44
        1.2.2.3 lac-1干扰株漆酶相对表达量分析  44-45
  2 RNA干扰载体的优化  45-56
    2.1 pFCNH的优化  46
    2.2 绿色荧光蛋白基因(GFP)的RNA干扰  46-56
      2.2.1 板栗疫病菌绿色荧光蛋白基因(GFP)表达株的构建  47-48
        2.2.1.1 绿色荧光蛋白基因(GFP)表达质粒的构建  47-48
        2.2.1.2 绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达株GFP/EP155的获得  48
      2.2.2 绿色荧光蛋白基因(GFP)RNA干扰质粒的构建  48-51
        2.2.2.1 GFP RNA干扰质粒正向干扰片断的克隆  50
        2.2.2.2 GFP RNA干扰质粒反向干扰片断的克隆  50-51
      2.2.3 GFP的RNA干扰  51-56
        2.2.3.1 GFP RNA干扰阳性转化株的筛选  51-52
        2.2.3.2 荧光显微镜观察干扰效果  52-53
        2.2.3.3 实时荧光定量PCR检测干扰效率  53-54
        2.2.3.4 GFP RNA干扰转化子的SOUTHERN杂交分析  54-56
第四章 讨论  56-59
参考文献  59-66
致谢  66-67
附录1 实验中用到的主要仪器  67

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 果树病虫害 > 坚果类病虫害
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