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影响低毒病毒累积量的病毒基因定位及其作用机制的研究

作　者: 林海燕
导　师: 陈保善
学　校: 广西大学
专　业: 微生物学
关键词: 板栗疫病菌 低毒病毒 病毒累积量 嵌合病毒 反式作用 点突变
分类号: Q939.4
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


低毒病毒(hypovirus)是一类存在于细胞质中的,无衣壳双链RNA病毒,因可以降低宿主板栗疫病菌的致病力而得名。根据遗传结构的不同,目前发现的低毒病毒可以归为四个种:CHV1、CHV2、CHV3和CHV4。迄今为止有六个低毒病毒分离株的全基因组序列已被报道,其中属于CHV1的有三个病毒株,即CHV1-EP713、CHV1-Euro7和CHV1-EP721。感染了CHV1-EP713、CHV1-Euro7和CHV1-EP721的板栗疫病菌菌株均表现出典型的低毒病毒相关症状。相对于CHV1-EP713来说,CHV1-Euro7和CHV1-EP721属于较为温和的病毒。序列对比分析显示,CHV1-EP721与CHV1-Euro7和CHV1-EP713在核苷酸水平上的同源性平均为99%和90%;在氨基酸水平上的同源性平均为98%和92%。但是CHV1-EP721在宿主中的累积量明显低于另外两个病毒。利用CHV1-EP721、CHV1-Euro7和CHV1-EP713的侵染性cDNA克隆,通过转染的方法将三种病毒分别导入EP155、Euro7(-v)和EP721(-v)三个不同遗传背景的无病毒菌株中,获得三组共九株不同组合的转染低毒菌株,它们均显示出低毒菌株的表型特征。检测转染菌株中病毒dsRNA的累积量,结果显示:尽管遗传背景不同,但同一病毒在不同的宿主中的病毒累积量均是相似的,结果说明病毒dsRNA在宿主中的累积量仅有病毒本身决定,与宿主无关。利用CHV1-EP721、CHV1-Euro7和CHV1-EP713较高的序列同源性,构建了CHV1-EP721和CHV1-Euro7,CHV1-EP721和CHV1-EP713之间ORF A/ ORF B互换的嵌合病毒。对转染株中的病毒dsRNA进行半定量分析显示,带有CHV1-EP721 ORF B的嵌合病毒713A721B和721AE7B的转染株中病毒dsRNA的累积量最低,而带有CHV1-EP713 ORF B的嵌合病毒721A713B累积量最高,表明影响低毒病毒累积量的病毒基因位于ORF B中。利用三个野生病毒和四个嵌合病毒对病毒通过分生孢子的传播效率进行检测,结果表明,低毒病毒通过分生孢子的传播效率与病毒在宿主中的累积量呈正相关。为了定位ORF B中影响低毒病毒累积量的病毒基因,本研究进一步构建了CHV1-EP721和CHV1-Euro7的系列ORF B嵌合病毒721/E7 NarI,E7/721 NarI,721/E7 PH,E7/721 PH,721/E7(5.3-7.8 k)和E7/721(5.3-7.8k)。并通过转染的方式导入无病毒野生型寄主EP721(-v)中,对转染株的病毒dsRNA累积量进行半定量分析,结果显示E7/721(5.3-7.8K)的累积量完全降低到CHV1-EP721的水平,而721/E7(5.3-7.8K)的累积量是CHV1-Euro7的70%。这些结果表明,决定病毒累积量的病毒基因定位于CHV1-EP721的ORF B中5.3-7.8k的区域,并且在ORF B中还存在着另外的与此基因编码产物相互作用而影响低毒病毒累积量的病毒基因。为了进一步研究病毒ORF B的5.3-7.8kb片段的编码产物在低毒病毒复制过程中的作用机制,构建了一系列携带5.3-7.8 kb区域不同片段长度的质粒pTr5.4、pTr4.1和pTr2.5,以测定其反式作用的效率。用这三种质粒对EP721进行转化,均筛选到促进病毒累积量的转化株,表明影响低毒病毒累积量的病毒基因产物可以通过反式作用增加病毒的累积水平。用融合了EGFP基因egfp的质粒pTr2.5G进行转化,不影响5.3-7.8 kb区域的反式互补作用。利用GFP方便的选择标记,进一步构建了带有GFP融合标签的CHV1-Euro7 ORF B中5.3-7.8 kb区域的不同片段长度的转化质粒pTr57G(5.3-7.0k)、pTr68G(6.4-7.7k)和pTr67G(6.4-7.0k)并分别用于转化EP721原生质体。三种质粒的转化株中均筛选到病毒累积量明显增加的转化株,从而将影响低毒病毒累积量的病毒基因精确定位到ORF B中6.4-7.0kb之间约600bp的区域。CHV1-EP721与CHV1-Euro7相比ORF B的6.4-7.0 kb区域中有四个氨基酸不同。对CHV1-EP721 ORF B相应片段的差异氨基酸的DNA序列分别进行突变,使Val(1426)突变为Ala,Lys(1439)突变为Glu,Glu(1495)突变为Gly,His(1496)突变为Arg。对带有点突变的6.4-7.0 kb片段反式转化株的病毒dsRNA累积量检测结果显示上述四个氨基酸中任一位点的突变都显著降低该片段的反式作用能力,病毒累积量无法达到野生型病毒相应片段反式增加的水平。本研究利用原核表达系统体外表达了低毒病毒ORF B中6.1-6.8 kb的序列,获得表达产物P4,免疫家兔制备了效价高达1∶10000的抗体;并利用Biacore分子相互作用系统初步分析了P4与其他病毒编码蛋白之间的相互作用。本论文中对影响低毒病毒累积量的病毒基因的定位及其作用机制的研究为探明低毒病毒的复制机制提供了参考依据。

全文目录


摘要  4-7
Abstract  7-14
第一章 前言  14-40
  1.1 双链RNA病毒  14-19
    1.1.1 双链RNA病毒的分类  15-16
    1.1.2 dsRNA病毒的复制、翻译和组装  16-19
      1.1.2.1 L-A的复制  16-17
      1.1.2.2 翻译  17-18
      1.1.2.3 病毒颗粒的包装  18-19
  1.2 双链RNA病毒对其宿主的影响  19-21
    1.2.1 导致宿主发生疾病或病害  19-20
    1.2.2 降低宿主的致病力  20
    1.2.3 分泌毒素  20
    1.2.4 影响植物对环境的适应能力  20-21
  1.3 几种重要植物病原菌中的DSRNA病毒  21-25
    1.3.1 低毒病毒  21-22
    1.3.2 荷兰榆树病致病菌中的dsRNA病毒  22-23
    1.3.3 立枯丝核菌中的dsRNA病毒  23-24
    1.3.4 燕麦疫病菌的病毒  24-25
  1.4 其他物种中的双链RNA病毒  25
    1.4.1 细菌中的dsRNA病毒  25
    1.4.2 昆虫及原生动物中的dsRNA病毒  25
  1.5 双链RNA病毒与单链(+)RNA的关系  25-26
  1.6 低毒病毒的研究进展  26-36
    1.6.1 低毒病毒的发现  26
    1.6.2 低毒病毒的遗传结构  26-28
    1.6.3 低毒病毒对板栗疫病菌影响的分子机制  28-35
      1.6.3.1 低毒病毒对板栗疫病菌信号传导途径的影响  28-33
      1.6.3.2 低毒病毒对板栗疫病菌转录组的影响  33-35
      1.6.3.3 低毒病毒对板栗疫病菌蛋白组的影响  35
    1.6.4 低毒病毒功能基因组学研究进展  35-36
  1.7 低毒病毒与马铃薯Y病毒在基因组结构上的相似性  36-39
    1.7.1 马铃薯Y病毒的遗传结构和蛋白功能  37-39
    1.7.2 低毒病毒  39
  1.8 本研究的目的和意义  39-40
第二章 材料与方法  40-63
  2.1.菌种  40-41
    2.1.1 细菌及真菌菌种  40
    2.1.2 菌种保存  40-41
  2.2.培养基及培养条件  41-42
    2.2.1 大肠杆菌  41
    2.2.2 板栗疫病菌  41-42
  2.3.抗生素、常用生化试剂及其使用浓度  42
  2.4 载体  42-44
    2.4.1 本研究中用到的质粒载体  42-43
    2.4.2 PCR产物克隆载体的制备  43-44
      2.4.2.1 T载体的制备  43
      2.4.2.2 平端PCR产物克隆载体的制备  43-44
  2.5 PCR扩增  44
    2.5.1 引物设计  44
    2.5.2 反应条件以及反应体系的设置  44
  2.6.重组质粒的构建及筛选  44-48
    2.6.1 PCR产物的克隆  44
    2.6.2 DNA酶切  44-45
    2.6.3 DNA片段的回收  45
    2.6.4 连接反应  45-46
    2.6.5 转化  46
      2.6.5.1 感受态的制备  46
      2.6.5.2 转化方法  46
    2.6.6 重组质粒的筛选和鉴定  46-48
      2.6.6.1 重组质粒的鉴别  46-47
      2.6.6.3 质粒快速提取和酶切鉴定  47-48
  2.7.低毒病毒DSRNA的分析  48-50
    2.7.1 低毒病毒dsRNA的提取和纯化  48
    2.7.2 低毒病毒dsRNA累积量的分析  48-50
      2.7.2.1 低毒病毒累积量的定量PCR检测  49-50
      2.7.2.2 病毒dsRNA的半定量分析  50
  2.8.板栗疫病菌的转化和转染  50-54
    2.8.1 原生质体的制备  50-51
    2.8.2 原生质体再生  51-52
    2.8.3 原生质体转化  52-53
      2.8.3.1 质粒DNA的准备  52
      2.8.3.2 转化  52
      2.8.3.3 转化株的纯化  52-53
    2.8.4 板栗疫病菌的转染  53-54
      2.8.4.1 RNA的体外合成  53
      2.8.4.2 转染  53-54
  2.9.低毒病毒通过分生孢子传播效率的检测  54
  2.10.板栗疫病菌总DNA的提取  54-55
    2.10.1 用于PCR检测的微量DNA提取  54
    2.10.2 大量总DNA的提取  54-55
  2.11.SOUTHERN杂交分析  55-56
    2.11.1 总DNA酶切  55
    2.11.2 转膜  55-56
    2.11.3 预杂交和探针标记  56
    2.11.4 洗膜  56
  2.12.病毒蛋白的表达、纯化及抗体制备  56-60
    2.12.1 病毒蛋白的原核表达  56-57
    2.12.2 蛋白SDS-PAGE检测  57-58
    2.12.3 包涵体的纯化  58-59
    2.12.4 包涵体的复性  59
    2.12.5 抗体制备及效价检测  59-60
  2.13.板栗疫病菌总蛋白和VESICLE的提取  60-61
    2.13.1 板栗疫病菌总蛋白的提取  60-61
    2.13.2 板栗疫病菌vesicle的提取  61
  2.14.WESTERN杂交检测板栗疫病菌总蛋白中的病毒蛋白  61
  2.15.病毒蛋白相互作用分析  61-63
    2.15.1 配体的偶联  62
    2.15.2 再生条件的确定  62
    2.15.3 与配体相互作用的分析  62-63
第三章 结果与分析  63-98
  3.1.低毒病毒累积量与真菌宿主菌株的关系  63-68
    3.1.1 CHV1-EP713,CHV1-Euro7和CHV1-EP721的基因组序列比对分析  63-65
    3.1.2 CHV1-EP713,CHV1-Euro7和CHV1-EP721在同一宿主EP721(-v)中病毒累积量的相对定量分析  65-66
    3.1.3 低毒病毒株系对不同宿主表型的影响以及在不同宿主中的病毒累积量  66-68
  3.2.CHV1-EP721和CHV1-EURO7、CHV1-EP713之间嵌合病毒的构建  68-76
    3.2.1 嵌合病毒721A/E7B和E7A/721B的构建  68-72
      3.2.1.1 构建策略  68-69
      3.2.1.2 嵌合病毒721A/E7B和E7A/721B重组质粒的获得  69-71
      3.2.1.3 嵌合病毒721A/E7B和E7A/721B转染株的获得  71-72
    3.2.2 嵌合病毒721A/713B和713A/721B的构建  72-76
      3.2.2.1 构建策略  72-74
      3.2.2.2 嵌合病毒721A/713B和713A/721B重组质粒的获得  74-75
      3.2.2.3 嵌合病毒721A/713B和713A/721B转染株的获得  75-76
  3.3.嵌合病毒721A/E7B、E7A/721B、721A/713B和713A/721B转染株中病毒DSRNA累积量的定量  76-77
  3.4.分生孢子传毒效率与病毒累积量的关系  77-78
  3.5.进一步构建嵌合病毒,定位影响低毒病毒累积量的病毒基因  78-86
    3.5.1 CHV1-EP721和CHV1-Euro7之间ORF B嵌合病毒重组质粒的构建  78-82
      3.5.1.1 嵌合病毒721/E7 NarI和E7/721 NarI的构建以及鉴定  78-80
      3.5.1.2 嵌合病毒721/E7 PH和E7/721 PH cDNA重组质粒的构建以及鉴定  80-82
      3.5.1.3 嵌合病毒721/E7(5.3-7.8 k)和E7/721(5.3-7.8k)cDNA重组质粒的构建及鉴定  82
    3.5.2 嵌合病毒的RT-PCR验证  82-84
    3.5.3 CHV1-EP721和CHV1-Euro7之间ORF B嵌合病毒转染株中病毒dsRNA累积量的半定量分析  84-86
  3.6.影响低毒病毒累积量的病毒基因的反式互补作用  86-91
    3.6.1 质粒的构建  86-88
    3.6.2 转化株的获得以及转化株中病毒dsRNA累积量的检测  88
    3.6.3 转化株的纯化及鉴定  88-89
    3.6.4 GFP的融合不影响5.3-7.8 kb片段的反式互补作用  89-90
    3.6.5 影响低毒病毒累积量的病毒基因的精细定位  90-91
  3.7.CHV1-EP721的6.4-7.0 KB片段内氨基酸的点突变  91-94
    3.7.1 点突变CHV1-EP721全长cDNA克隆的构建  91-93
    3.7.2 CHV1-EP721的6.4-7.0 kb片段点突变的质粒的构建  93-94
  3.8.低毒病毒CHV1-EURO7的6.1-6.8 KB片段的原核表达  94-95
  3.9.BIACORE检测低毒病毒CHV1-EUR07的6.1-6.8 KB片段原核表达产物P4与其他病毒蛋白的相互作用  95-98
第四章 总结与讨论  98-104
  4.1.影响低毒病毒累积量的因素在于病毒本身  98
  4.2.影响低毒病毒CHV1-EP721病毒DSRNA累积量的病毒基因定位于ORF B的5.3-7.8 KB区域  98-99
  4.3.低毒病毒通过分生孢子的传播效率与病毒累积量成正相关  99-100
  4.4.影响低毒病毒累积量的病毒基因的编码产物能够反式促进病毒在宿主中的累积水平  100-101
  4.5.CHV1-EP721 ORF B的6.4-7.0 KB区域中四个氨基酸的定点突变降低了该区域编码产物的反式作用能力  101-102
  4.6.CHV1-EURO7 ORFB的6.4-7.0 KB区域编码产物成熟加工形式及其与其他病毒蛋白的相互作用的研究  102
  4.7.问题与展望  102-103
  4.8.本研究的创新点  103-104
参考文献  104-115
致谢  115-116
攻读博士学位期间所发表的论文和取得的研究成果  116

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物分类学（系统微生物学） > 病毒（滤过性病毒）
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