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假蕈状芽孢杆菌B-60菌株纤溶酶的分离纯化与性质分析

作　者: 顾昌玲
导　师: 朱宝成
学　校: 河北大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 假蕈状芽孢杆菌 纤溶酶 分离纯化 酶学性质
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


血栓栓塞性疾病(thrombotic disease, TD)发病率、致残率、致死率皆高,已成为严重危害人类健康的疾病之一。药物溶栓是目前临床应用最广泛、最有效的治疗手段。迄今为止,溶栓剂已发展了三代,但依然存在一定的缺陷,仍有待开发安全有效的新型溶栓剂。本研究旨在从微生物中开发出一种新型溶栓剂。从自然界分离的一株胞外产纤溶酶的芽孢杆菌B-60菌株,通过对它的形态、生理生化特征进行研究,对其16S rDNA序列进行测定与比对,发现芽孢杆菌B-60菌株与假蕈状芽孢杆菌的形态、生理生化特征相符,与其16S rDNA序列也有高达99.38%的同源性。根据多相分类原则,认为芽孢杆菌B-60菌株为假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)。采用单因子试验和正交试验对产纤溶酶的假蕈状芽孢杆菌B-60的发酵条件进行优化。产纤溶酶最佳条件为：蔗糖15 g/L,豆饼粉15 g/L, MnSO4·H2O 3.4 g/L, CaCl2 3.3 g/L, K2HPO4·3H2O 0.8 g/L, KH2PO4 0.2 g/L, MgSO4·7H2O 7.4g/L;培养温度32℃,培养基初始pH6.5～7.0,装液量250 mL的三角瓶50 mL,接种量2%～6%,发酵时间56 h左右。Ca2+、Mg2+、K+、Mn2+对酶活有促进作用,Zn2+、Fe2+对酶活有强烈抑制作用。优化后,点样10μL发酵液溶圈直径为19.5mm,溶圈面积为298 mm2。利用硫酸铵沉淀和阴离子交换色谱从假蕈状芽孢杆菌B-60菌株中分离纯化出具有纤溶活性的单体蛋白单一组分(BpFE),并对BpFE性质进行分析。BpFE表观分子量为34 kD。它在4℃～50℃活性较稳定,50℃以上活性急剧下降；作用最适pH值为pH5～6,在pH5-10活性较稳定,在pH3.0,活性几乎丧失；金属离子Ca2+, Mg2+, Mn2+对酶活有轻微促进作用,Cu2+则强烈抑制酶活。苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制它的活性。BpFE经胰蛋白酶和胃蛋白酶降解后,活性上升。N端15个氨基酸序列为VTGTN AVGTG KGVLG,比对结果表明,BpFE N端氨基酸序列与蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、炭疽杆菌和乳杆菌的bacillolysin, neutral protease, hydrolase的一部分序列同源性为100%。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-11
引言  11-13
第1章 绪论  13-27
  1.1 血栓的形成及溶解机制  13-15
    1.1.1 血栓形成机制  13-14
    1.1.2 栓溶解机制  14-15
  1.2 溶栓药物的研究进展及前景展望  15-24
    1.2.1 溶栓药物的来源  16-17
    1.2.2 溶栓药物的发展历程  17-22
    1.2.3 现有溶栓药物的主要缺陷  22-23
    1.2.4 新型溶栓药物的开发及发展趋势  23-24
  1.3 微生物溶栓药物研究概况  24-27
第2章 纤溶酶产生菌株Bacillus B-60的鉴定  27-32
  2.1 材料与试剂  27
    2.1.1 菌株  27
    2.1.2 培养基  27
    2.1.3 试剂  27
  2.2 方法  27-28
    2.2.1 纤溶活性测定  27
    2.2.2 B-60菌株的鉴定  27-28
  2.3 结果与讨论  28-32
    2.3.1 纤溶活性测定  28
    2.3.2 分类鉴定  28-32
第3章 假蕈状芽孢杆菌B-60菌株的发酵条件优化  32-41
  3.1 材料与试剂  32
    3.1.1 菌株  32
    3.1.2 培养基  32
    3.1.3 试剂  32
  3.2 方法  32-33
    3.2.1 菌株培养方法  32
    3.2.2 种子生长曲线绘制及产酶高峰  32-33
    3.2.3 纤溶酶活性的测定  33
  3.3 结果与分析  33-39
    3.3.1 B.pseudomycoides B-60菌株种子生长曲线与发酵时间  33
    3.3.2 B.pseudomycoides B-60菌株发酵培养基组成的优化  33-38
    3.3.3 发酵条件的优化  38-39
  3.4 讨论  39-41
第4章 假蕈状芽孢杆菌B-60菌株的蛋白分离纯化及性质  41-50
  4.1 材料与试剂  41
    4.1.1 菌株  41
    4.1.2 培养基  41
    4.1.3 试剂  41
  4.2 方法  41-44
    4.2.1 B.pseudomycoides B-60菌株蛋白提取物的制备  41-42
    4.2.2 初步鉴定B.pseudomycoides B-60菌株提取物的成分  42
    4.2.3 B.pseudomycoides B-60蛋白的分离纯化  42
    4.2.4 检测分离效果和目标蛋白的相对分子质量(Mr)  42
    4.2.5 B.pseudomycoides B-60纤溶酶(BpFE)的N-端氨基酸序列测定  42-43
    4.2.6 蛋白质浓度标准曲线和尿激酶活力标准曲线的制作  43
    4.2.7 B.pseudomycoides B-60菌株提取物及BpFE纤溶比活力测定和比较  43
    4.2.8 BpFE的最适温度和最适作用pH值  43
    4.2.9 蛋白酶抑制剂对BpFE活性的影响  43
    4.2.10 金属离子对BpFE活性的影响  43-44
    4.2.11 胰蛋白酶和胃蛋白酶对BpFE的作用  44
  4.3 结果  44-48
    4.3.1 纤溶活性成分的鉴定  44
    4.3.2 DEAE阴离子交换色谱  44-45
    4.3.3 BpFE N-端序列  45
    4.3.4 B.pseudomycoides B-60菌株提取物及BpFE纤溶比活力测定和比较  45-46
    4.3.5 BpFE的温度适应性和酸碱稳定性  46-47
    4.3.6 蛋白酶抑制剂对BpFE活性的影响  47-48
    4.3.7 金属离子对BpFE活性的影响  48
    4.3.8 胰蛋白酶和胃蛋白酶对BpFE的作用  48
  4.4 讨论  48-50
第5章 结论  50-51
参考文献  51-59
在读期间发表的学术论文  59-60
致谢  60

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 酶工程
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