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盐穗木液泡膜Na~+/H~+反向运输载体基因的克隆和功能分析

作　者: 关波
导　师: 张富春
学　校: 新疆大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 盐穗木 HcNHX1 基因克隆转基因拟南芥耐盐性
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

植物消除Na+毒害的策略主要有:减少Na+的吸收、Na+的外排和Na+的区隔化三种。盐生植物可以不同程度的利用Na+进行渗透调节,能够在从大量Na+中选择性的利用K+的同时,还积累足够的Na+用于渗透调节。将Na+区隔化至液泡中是一个间接的主动运输过程,液泡膜Na+ /H+反向运输载体蛋白在质子泵V-ATPase和V-PPase建立的跨液泡膜质子电化学梯度下进行跨液泡膜的Na+/H+反向运输。这不仅能够降低胞质内的Na+浓度、维持胞质正常的K+/Na+比值,还可以有效利用储存在液泡中的Na+作为渗透剂。在多种植物中过表达NHX基因的研究显示NHX可以提高转基因植株的耐盐性,说明液泡膜Na+/H+反向运输载体在植物的耐盐性中发挥重要作用。盐穗木(Halostachys caspica)是广泛分布于新疆干旱或半干旱盐碱荒漠环境中的一种极端耐盐的多年生灌木。其茎和叶已高度特化为同化枝,肉质化程度较高,实验室条件下盐穗木最高可以耐受700 mmol/L NaCl的处理。研究它的分子及生理水平的耐盐机理可能会对改良作物性状提供理论依据,对培育耐盐碱作物品种具有重要的意义。本研究通过RT-PCR的方法,利用同源序列设计多条引物,从盐穗木中克隆获得Na+/H+反向运输载体基因的核心片段。再通过3’-RACE技术克隆获得Na+/H+反向运输载体基因的3’端序列。根据序列重叠区拼接后设计特异引物,PCR扩增获得Na+/H+反向运输载体基因1656 bp的开放阅读框,该基因编码一个551个氨基酸的多肽。生物信息学分析结果显示,HcNHX1与其他高等植物液泡膜Na+/H+反向运输载体基因推定的氨基酸序列间有着高度的同源性(71~96%),与盐生灌木盐爪爪KfNHX1的相似性最高,达到96%。与拟南芥(A. thaliana),水稻(O. sativa)和玉米(Zea mays)的NHX1相似性分别为74%,72%和71%。系统进化分析表明,HcNHX1同双子叶盐生植物盐地碱蓬(S. salsa),滨藜(A. gmelini),灰绿藜(C. glaucum)和盐爪爪(K. foliatum)在进化上具有较近的关系,且与同源性较高的液泡膜型Na+/H+反向运输载体形成了一个进化分支,而质膜型Na+/H+反向运输载体如AtSOS1,OsSOS1和TaSOS1则形成了另一个分支。蛋白亲水性预测分析表明,该蛋白可能有12个跨膜区,具有Na+/H+反向运输体蛋白氨基酸组成中高度保守的Amiloride结合位点。分析结果说明,本研究所克隆HcNHX1属于植物液泡膜Na+/H+反向运输载体家族成员。通过半定量RT-PCR检测,结果显示盐胁迫处理的盐穗木幼苗中HcNHX1基因的表达量随盐胁迫浓度的增加而增加,表明HcNHX1基因的表达受盐胁迫诱导。ABA处理也可上调HcNHX1基因的表达,暗示HcNHX1基因可能受到ABA依赖信号途径的调控。采用花序浸染法获得转HcNHX1基因的拟南芥。对转基因拟南芥的分子检测(PCR和Northern blot)表明HcNHX1基因在拟南芥中成功表达。盐胁迫下,转基因拟南芥莲座叶中可以积累更多的Na+,并且生长状态更好,生物量的积累显著高于野生型拟南芥。过表达盐穗木液泡膜Na+/H+反向运输体基因HcNHX1的拟南芥耐盐性的得到显著提高。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一部分文献综述  9-33
  第一章盐生植物耐盐机理的研究进展  9-26
    1 盐生植物对盐渍环境的生长适应  9
    2 盐生植物应对盐渍环境的渗透调节  9-12
    3 盐渍环境下盐生植物对单价离子的摄入和运输  12-15
      3.1 Na+的摄入  12-14
      3.2 K+的摄入及积累  14-15
      3.3 Cl-的摄入及积累  15
    4 植物液泡膜Na+/H+反向运输载体蛋白研究进展  15-17
      4.1 液泡膜Na+/H+反向运输载体蛋白的结构  15-16
      4.2 液泡膜Na+/H+反向运输载体蛋白在植物耐盐中的分子机理  16-17
    5 结论与展望  17-18
    参考文献  18-26
  第二章植物基因表达转录分析中内参基因的研究进展  26-33
    1 目前常用的内参对照基因  26-27
      1.1 肌动蛋白基因（actin）  26
      1.2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(G3PDH/GAPDH)  26-27
      1.3 核糖体亚单位  27
      1.4 肽链延伸因子（ef1α）基因  27
    2 植物基因表达研究中内参基因的选择标准  27-29
      2.1 选作内参的管家基因其本身的表达水平应具有良好的稳定性  28
      2.2 所选内参基因的表达在给定实验设计中是恒定的  28-29
      2.3 内参基因和目标基因的表达水平应当相近  29
    3 内参基因的确定要根据具体实验条件进行验证  29-30
    4 结语  30
    参考文献  30-33
第二部分实验部分  33-67
  第一章盐穗木液泡膜Na+/H+反向运输载体基因(HcNHX1)的克隆和表达分析  33-47
    1 材料及主要试剂  33-35
      1.1 植物材料培养与处理  33
      1.2 酶和试剂  33-34
      1.3 实验引物  34-35
    2 实验方法  35-38
      2.1 盐穗木总RNA 的提取  35-36
      2.2 盐穗木NHX 基因核心片段的获得  36
      2.3 3’RACE 获得盐穗木NHX 基因3’端序列  36-37
      2.4 盐穗木NHX 基因(HcNHX1) 开放阅读框的获得  37
      2.5 盐穗木NHX 基因(HcNHX1)的生物信息学分析  37
      2.6 盐胁迫及ABA 处理下盐穗木NHX 基因(HcNHX1)表达规律的分析  37-38
    3 结果  38-43
      3.1 盐穗木NHX 基因(HcNHX1)开放阅读框(ORF)的克隆  38
      3.2 HcNHX1 基因氨基酸序列的生物信息学分析  38-42
      3.3 盐胁迫下HcNHX1 基因的表达分析  42-43
      3.4 ABA 处理下HcNHX1 基因的表达分析  43
    4 讨论  43-44
    参考文献  44-47
  第二章过表达盐穗木液泡膜 Na+  47-67
    1 材料及主要试剂  47-49
      1.1 植物材料  47
      1.2 菌株和质粒  47
      1.3 主要试剂  47-48
      1.4 Northern 杂交有关试剂  48
      1.5 培养基  48-49
    2 实验方法  49-57
      2.1 植物表达载体pCAMBIA1301-HcNHX1 的构建  49
      2.2 根癌农杆菌的转化  49-50
      2.3 目的基因转化拟南芥  50-51
      2.4 转化植株的的PCR 鉴定  51-52
      2.5 转化植株的的RT-PCR 分析  52-53
      2.6 转化植株的Northern blot 检测  53-56
      2.7 盐胁迫下转基因植株耐盐性分析和组织离子含量的测定  56-57
    3 结果  57-63
      3.1 植物表达载体的构建及转化根癌农杆菌及PCR 验证  57-58
      3.2 潮霉素抗性苗的筛选及转化子的遗传分析  58-59
      3.3 转化植株的分子鉴定  59-60
      3.4 盐胁迫下转基因植株的耐盐性分析及组织离子含量的测定  60-63
    4 讨论  63-64
    参考文献  64-67
第三部分结论与展望  67-68
  结论  67
  展望  67-68
致谢  68-69
个人简历  69

盐穗木液泡膜Na~+/H~+反向运输载体基因的克隆和功能分析

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