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盐爪爪和盐穗木的耐盐生理生化及耐盐相关基因的克隆与表达研究

作　者: 曾幼玲
导　师: 张富春
学　校: 新疆大学
专　业: 动物学
关键词: 盐爪爪盐穗木耐盐生理生化基因克隆序列分析 NHX1 液泡膜ATPase基因液泡膜焦磷酸酶基因 BADH P5CS
分类号: Q943.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

土壤盐分是制约作物产量的主要因素，它可使作物尤其是灌溉农业的作物减产。土壤盐分过高还可以造成盐碱地，限制土地的利用。当前，采用生物技术提高作物的耐盐性，使作物在盐胁迫环境中能正常生长并提高产量，正受到越来越多的关注并取得了一定的进展。植物受到盐胁迫时其体内会经过多种变化。植物通过多种生化途径来体现自身对盐耐受的能力。如在盐胁迫下，植物能保水和吸水，保护叶绿体和维持离子平衡等。必要的路径包括那些盐胁迫下导致渗透活性代谢物的产生，特殊的蛋白和一些清除自由基的抗氧化物酶和分子伴侣以控制植物体内的离子平衡和水分流向。在盐胁迫下，大多数植物把Na⁺区隔化入液泡中，为消除Na⁺在细胞质中的不利影响提供了一个有效机制，并且区隔化在液泡中的NaCl还可作为渗透剂以保持渗透势驱动水分进入细胞。Na⁺运输到液泡中是由液泡膜上Na⁺/H⁺逆向转运蛋白完成的，需要靠跨液泡膜的H⁺梯度提供驱动力，而H⁺梯度的形成依赖于液泡膜上的两种质子泵：H^-PPase酶和H⁺-ATP酶。盐爪爪和盐穗木是两种非常耐盐的藜科盐生植物，在新疆盐碱地广布。本研究从生理和分子角度对其耐盐性进行了初步的探讨，开展这两种盐生植物耐盐相关基因的克隆及盐爪爪液泡膜上多个耐盐相关基因的遗传工程，为作物和林木的遗传改良奠定坚实的理论和实验基础。研究工作首先对盐爪爪和盐穗木在种子萌发阶段的耐盐性进行了比较研究，表明盐爪爪和盐穗木都是很耐盐的盐生植物，在种子萌发期，盐穗木比盐爪爪更耐盐；NaCl和等渗的聚乙二醇（PEG）对种子的萌发都产生抑制作用，且PEG的抑制程度大于等渗的NaCl。在总体水平上都降低了种子的萌发率，推迟了种子的初始萌发时间和延长了种子的萌发时间；低浓度的NaCl溶液对种子萌发的幼苗生长起着促进作用。在100 mmol·L^-1NaCl处理时，两种盐生植物幼苗的胚根和幼芽长度都达到最大值，幼苗的生长状况也最好。对盐爪爪和盐穗木在盐胁迫下的耐盐生理生化做了检测，包括Na⁺，K⁺，Ca²⁺含量的测定，植物叶脯氨酸和水势的变化，丙二醛和超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性的分析。结果为Na⁺和脯氨酸都是有效的渗透调节剂，处于低水势的植物细胞仍旧能从细胞外高浓度的盐溶液中吸收水分。而且作者认为对于一些很耐盐的盐生植物，长期的进化使其该类植物适应并需要盐的环境才能生长得更好。实验证明盐爪爪和盐穗木的生长是需盐的，这两种盐生植物在相对低的盐度环境中生长是合适的环境，而在没有盐和高浓度的盐环境中生长是逆境。采用同源序列法和race技术克隆了盐爪爪和盐穗木盐相关的3类基因的读码框，极大地丰富了植物的耐盐基因资源。分别为（1）获得了盐爪爪和盐穗木液泡膜焦磷酸酶（H⁺-pyrophosphatase）基因，分别命名为KfVP1和HcVP1，读码框序列长度都为2295bp，编码764个氨基酸，GenBank登陆号分别为EF114315和EF471358；（2）获得了盐爪爪和盐穗木液泡膜ATPase B亚基（VHA-B）基因，分别命名为KfVHA-B和HcVHA-B，读码框的序列长度都为1467bp，编码488个氨基酸，GenBank登陆号分别为EF114316和EF471357；（3）获得了盐爪爪和盐穗木催化合成渗透调节物质甜菜碱的甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因，分别命名为KfBADH和HcBADH，读码框序列长度都为1503bp，编码500个氨基酸残基，GenBank登陆号分别为DQ923617和EF471356。利用半定量RT-PCR的方法初步获得了盐爪爪液泡膜上耐盐相关基因KfVP1，KfVHA-B和KfNHX1及甜菜碱醛脱氢酶KfBADH和脯氨酸合成关键酶P5CS基因在盐(0，100，300，500，700 mmol·L^-1)胁迫4d条件下各基因在mRNA水平上的表达情况。检测的各基因均受盐的诱导。P5CS和KfBADH基因的表达随着盐浓度的升高而表达逐渐增强，而脯氨酸的含量也随着盐胁迫程度的增强而在盐爪爪肉质化叶内积累更多，说明脯氨酸和甜菜碱作为重要的渗调物质，在植物逆境胁迫中可能发挥着重要的作用。没有经过NaCl处理的盐爪爪，其肉质叶中液泡膜上的3个基因NHX1，VHA-B和VP1基因在转录水平上的表达受到明显抑制或者表达不强，而经不同浓度NaCl处理的盐爪爪植株叶，其各基因的表达表现差异。KfNHX1基因在受到300 mmol·L^-1NaCl处理时表达达到最强；KfVP1基因在100 mmol·L^-1NaCl处理时表达最强，随着盐浓度的提高表达依次减弱；KfVHA-B基因在0和100 mmol·L^-1NaCl处理时，表达差异不明显，而在300，500和700 mmol·L^-1NaCl处理时表达能持续增强，由此推测盐爪爪液泡膜上H⁺-PPase酶和H⁺-ATP酶这两种酶在不同浓度的盐胁迫下可以持续供能。构建了盐爪爪KfVP1和KfNH1基因与GFP（绿色荧光蛋白基因）的融合植物表达载体，分别为pCAMBIA1301-1-KfdtVP1-GFP，pCAMBIA1301-1-KfdtNHX1-GFP，通过基因枪轰击洋葱表皮细胞，利用荧光倒置显微镜观察盐爪爪这两个基因在洋葱表皮细胞中的瞬时表达部位。结果表明盐爪爪KfVP1和KfNHX1可能定位在液泡膜上，至少在膜系统上。构建了盐爪爪液泡膜上离子转运蛋白相关基因KfVP1和KfNHX1的植物表达载体，分别为pCAMBIA1301-1-KfVP1，pCAMBIA1301-1-KfNHX1和pBin438-KFNHX1 3种植物表达载体，获得了KFVP1和KfNHX1当代烟草转基因植株和用400 mmol·L^-1 NaCl胁迫烟草的耐盐表型和衡量叶细胞膜受损的相对电导率生理实验说明KfVP1具有一定的耐盐功能。后续的工作将继续通过农杆菌介导的遗传转化及分子和生理检测比较双转盐爪爪液泡膜上的VP1和NHX1基因和单转VP1和NHX1一个基因的耐盐性差异。本研究为全面理解盐爪爪和盐穗木的耐盐性提供了初步的参考。为进一步利用盐爪爪耐盐基因资源开展作物和林木的遗传工程，使其获得更优良的性状，具有重要的现实和生态意义。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
第一部分文献综述  13-41
  第一章植物耐盐的生理生化反应  13-22
    1 植物耐盐的生理机制  13-15
    2 植物生理耐盐工程新进展  15-18
    3 结论与展望  18-22
  第二章盐胁迫下植物体内应答基因的研究进展  22-30
    1 渗透保护物质生物合成的关键酶基因  22-24
    2 参与重建膜内外离子平衡的膜蛋白  24-26
    3 编码转录因子的调节基因  26-30
  第三章液泡膜离子转运相关蛋白与植物耐盐性  30-41
    1 NHX及其基因家族与植物耐盐性  31-32
    2 液泡膜H~+转运无机焦磷酸酶与植物耐盐性  32-33
    3 液泡膜H~+-ATP酶与植物耐盐性  33-34
    4 NHX,VHA,V-PPase在盐胁迫时的相关性  34-36
    5 植物液泡膜NHX1和VP1基因的遗传工程研究进展  36-41
第二部分实验部分  41-120
  第一章盐爪爪和盐穗木耐盐的生理生化  41-62
    一、盐分和水分胁迫对盐爪爪和盐穗木种子萌发的影响  41-49
      1 材料与方法  41-42
      2 结果与分析  42-48
      3 讨论  48-49
    二、盐爪爪和盐穗木的耐盐生理生化  49-62
      1 材料与方法  49-51
      2 结果  51-57
      3 讨论  57-62
  第二章盐爪爪和盐穗木液泡膜上耐盐相关基因VP1、VHA-B及甜菜碱醛脱氢酶基因BADH的克隆和序列分析  62-94
    1 材料和试剂  63-65
    2 方法  65-67
    3 实验结果  67-94
      第一类基因:盐爪爪和盐穗木液泡膜焦磷酸酶基因的克隆  67-76
      4 讨论  76-77
      第二类基因:盐爪爪和盐穗木液泡膜ATPase B亚基(VHA-B)基因的克隆  77-83
      4 讨论  83-84
      第三类基因:盐爪爪和盐穗木甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的克隆  84-89
      4 讨论  89-94
  第三章盐爪爪液泡膜上耐盐相关基因KfVP1、KfVHA-B和KfNHX1及甜菜碱醛脱氢酶KfBADH和脯氨酸关键合成酶P5CS基因在盐胁迫下mRNA水平的表达特性  94-101
    1 材料和方法  95-97
    2 实验结果  97-98
    3 讨论  98-101
  第四章盐爪爪KfVP1和KfNHX1基因的表达定位研究  101-109
    1 材料与方法  101-105
    2 实验结果  105-107
    3 讨论  107-109
  第五章盐爪爪液泡膜上离子转运蛋白相关基因KfVP1和KfNHX1植物表达载体的构建和单转和双转基因的初步研究  109-120
    1 材料和方法  110-112
    2 技术路线  112-113
    3 实验结果  113-120
第三部分结论与展望  120-123
附录1 英文缩略语  123-125
致谢  125-126
个人简历  126-127

盐爪爪和盐穗木的耐盐生理生化及耐盐相关基因的克隆与表达研究

内容摘要

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