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骨桥蛋白与TIP30在口腔鳞癌中的表达及相关性研究

作　者: 潘淑婷
导　师: 周中华
学　校: 第二军医大学
专　业: 口腔临床医学
关键词: 口腔鳞状细胞癌骨桥蛋白 TIP30 实时荧光定量PCR 免疫组织化学
分类号: R739.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景：口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的3%。其好发部位为舌、牙龈、颊粘膜等，是发病率和病死率较高的恶性肿瘤之一，特别是舌癌呈恶性侵润性生长、易转移，颈部淋巴结转移率约为60-80%。肿瘤术后局部复发和侵袭转移是导致患者术后生存率较低的重要原因，为了提高口腔鳞癌的早期发现、早期诊断、早期治疗，需深入了解口腔鳞癌发生发展、侵袭转移机制。目前对肿瘤的研究已广泛并逐步深入至基因、分子和蛋白水平，但仍需大量研究探讨口腔鳞癌的发生发展机制，及其对预后的影响。深入研究并逐步揭示口腔鳞癌的肿瘤标志物和抑癌基因，有利于完善现有的诊断和治疗手段，具有重要的临床意义。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种富含唾液酸的分泌型磷酸化糖蛋白，骨桥蛋白的合成和分泌可来自多种细胞和组织，是一种肿瘤转移的相关蛋白。骨桥蛋白可以加速细胞外基质的降解并且促进肿瘤血管的形成，从而提高肿瘤细胞的侵袭和转移能力。研究发现CD44和整合素可做为细胞粘附分子（CAM）和细胞因子来介导OPN参与体内众多的生理和病理过程。国内外学者的大量研究证实OPN可在多种肿瘤组织中高表达，另有研究表明OPN也参与了头颈部鳞状细胞癌的发生发展过程。OPN在正常口腔黏膜中几乎不表达，而在口腔鳞癌组织中高表达。在口腔黏膜癌变过程中，OPNmRNA表达逐渐升高，并且，OPN的表达与临床分期和淋巴结转移成正相关。TIP30是新近发现的一种抑癌基因，可抑制肿瘤细胞的增殖和转移侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤血管的生成，通过以上机制TIP30可起到抑癌的作用。现阶段的研究表明，TIP30对G0～G1期细胞有阻断作用，从而降低了S期细胞比例，导致肿瘤细胞增殖过程停滞不前；TIP30还可抑制血管内皮生长因子(VEGF)的转录和表达从而阻断肿瘤组织血供的构建，缺乏血供的肿瘤组织不能有效地浸润和转移，从而抑制肿瘤细胞扩散；此外，TIP30也通过诱导凋亡基因Bad的表达从而促进肿瘤细胞的凋亡。第二军医大学肿瘤研究所研究证实TIP30能够抑制OPN的转录，下调OPN的mRNA和蛋白表达水平，进而抑制肝癌细胞的增殖及其对细胞外基质的侵袭。目前抑癌基因TIP30和骨桥蛋白在口腔鳞癌中的相关研究较少，尤其是TIP30在口腔鳞癌中的作用尚未完全明确。本课题着重探讨OPN和TIP30在口腔鳞癌中的表达情况，初步探讨其相关性。研究目的：探讨口腔鳞癌中骨桥蛋白和TIP30的表达情况，初步探讨其相关性。研究方法：通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测口腔鳞癌组织中和癌旁组织中（n=18）骨桥蛋白mRNA及TIP30mRNA表达情况；采用免疫组织化学EnVisionT M法检测口腔鳞癌组织石蜡标本（n=70）和正常口腔黏膜（n=20）中骨桥蛋白和TIP30的蛋白表达情况，运用Image Pro Plus6.0图像分析软件进行累计光密度（IOD）值分析，并采用SPSS17.0软件分析不同临床、病理学特征下口腔鳞癌组织中骨桥蛋白和TIP30的蛋白表达情况；根据上述两部分结果进一步分析其相关性。实验结果：1、OPN mRNA在口腔鳞癌组织中和癌旁组织中的表达比较采用RT-PCR法，得出Δ CT癌=8.36±2.16，Δ CT癌旁=9.58±1.94，可见口腔鳞癌组织中的Δ CT值低，而癌旁组织中的Δ CT值高，根据公式Δ CT=CT目的基因-CT管家基因，Δ Δ CT=Δ CT癌-Δ CT癌旁，Δ CT值与基因拷贝数成反比，即OPNmRNA在口腔鳞癌组织中的表达要高于癌旁组织中。进一步可计算出OPN在口腔鳞癌组织中mRNA表达/癌旁组织中mRNA表达=2-Δ Δ CT；18例患者口腔鳞癌组织标本中均检测到OPN表达，阳性率为100%。其中，15例标本中OPN mRNA在口腔鳞癌组织中与在癌旁组织中T/N倍数大于2倍，再次表明OPN在口腔鳞癌组织中的表达明显高于癌旁组织中。应用SPSS17.0软件对口腔鳞癌组织和癌旁组织的Δ CT值进行配对t检验，得出t值=6.828（P <0.001），具有统计学意义。2、TIP30mRNA在口腔鳞癌组织中和癌旁组织中的表达比较采用RT-PCR法，得出Δ CT癌=9.61±1.42，Δ CT癌旁=8.35±1.65，可见口腔鳞癌组织中的Δ CT值高，而癌旁组织中的Δ CT值低，根据公式Δ CT=CT目的基因-CT管家基因，Δ Δ CT=Δ CT癌-Δ CT癌旁，Δ CT值与基因拷贝数成反比，即TIP30mRNA在癌旁组织中表达要高于口腔鳞癌组织中。进一步可计算出TIP30在口腔鳞癌组织中mRNA表达/癌旁组织中mRNA表达=2-Δ Δ CT，其中TIP30mRNA在14例癌旁组织中与口腔鳞癌组织中N/T倍数大于2倍，表明TIP30在癌旁组织中表达明显高于口腔鳞癌组织中。应用SPSS17.0软件对口腔鳞癌组织和癌旁组织的Δ CT值进行配对t检验，得出t值=10.234（P <0.001），具有统计学意义。3、OPN在口腔鳞癌组织中和正常口腔黏膜中的蛋白表达水平比较采用免疫组织化学EnVisionT M法检测正常口腔黏膜石蜡切片中和口腔鳞癌组织石蜡切片中OPN的表达情况，OPN在口腔鳞癌组织中和正常口腔粘膜中的表达有差异，OPN在正常口腔黏膜中几乎不表达，而在口腔鳞癌组织中高表达。每张切片随机选取不重叠的5个高倍镜视野(400倍)，应用Image Pro Plus6.0图像处理软件分别计算每个高倍镜视野的OPN的IOD值。得出IOD癌=66096.0±10921.0，IOD正常=46748.0±9513.3，应用SPSS17.0软件对口腔鳞癌组织和正常口腔黏膜的Δ CT值进行Wilcoxon秩和检验，得出Z值=5.62（9P<0.001），具有统计学意义。对70例口腔鳞癌患者石蜡标本根据临床分期可分为I期（40例），II期（12例），III～IV期(18例)，各期的IOD值依次为60695.0±8948.5、68780.0±5825.2、76308.0±9714.8，采用Kruskal-Wallis H检验，得出P<0.001，具有统计学意义，提示在不同临床分期之间OPN的表达情况有差异，且随着临床分期的增加，其表达逐渐增强。根据淋巴结转移情况将70例口腔鳞癌石蜡标本分为淋巴结转移组（12例）和无淋巴结转移组（58例），其中淋巴结转移组的IOD值为78484.0±8780.2，无淋巴结转移组IOD值为63532.0±9514.6，采用Wilcoxon秩和检验，得出P<0.001，具有统计学意义，提示在不同的淋巴结转移情况之间OPN的表达有差异，且OPN在淋巴结转移组的表达高于无淋巴结转移组。同时还对70例口腔鳞患者癌石蜡标本分别进行性别、年龄、病理分级、原发部位分组，并依次计算OPN表达的IOD值，经统计分析，未发现有统计学差异。4、TIP30在口腔鳞癌组织中和正常口腔黏膜中的蛋白表达水平比较采用免疫组织化学EnVisionT M法检测正常口腔黏膜石蜡切片中和口腔鳞癌组织石蜡切片中TIP30的表达情况，TIP30在口腔鳞癌组织中和正常口腔黏膜中的表达有差异，且TIP30在正常口腔黏膜中高表达，而在口腔鳞癌组织中相对低表达。每张切片随机选取不重叠的5个高倍镜视野(400倍)，应用Image ProPlus6.0图像处理软件分别计算每个高倍镜视野的TIP30的IOD值。得出IOD癌=28566.0±6887.4，IOD正常=47486.0±11625.0，应用SPSS17.0软件对口腔鳞癌和正常口腔鳞癌的Δ CT值进行Wilcoxon秩和检验，得出Z值=5.983（P<0.001），具有统计学意义。对70例口腔鳞癌患者石蜡标本根据临床分期分为I期（40例），II期（12例），III～IV期(18例)，各期的IOD值依次为33036.0±4510.3、25930.0±3896.3、21304.0±5225.4，采用Kruskal-Wallis H检验，得出P<0.001，提示在不同的临床分期之间TIP30表达有差异，且随着临床分期的增加，其表达逐渐减弱。根据淋巴结转移情况将70例口腔鳞癌患者石蜡标本分为淋巴结转移组（12例）和无淋巴结转移组（58例），其中淋巴结转移组的IOD值为19590.0±3368.5，无淋巴结转移组IOD值为30423.0±5896.0，采用Wilcoxon秩和检验，得出P<0.001，具有统计学意义，提示在不同的淋巴结转移情况之间TIP30的表达有差异，TIP30在无淋巴结转移组的表达高于淋巴结转移组。同时还对70例口腔鳞癌患者石蜡标本分别进行性别、年龄、病理分级、原发部位分组，并依次计算TIP30表达的IOD值，经统计学分析，未发现有统计学差异。5、18例口腔鳞癌组织标本OPN与TIP30相关性分析利用RT-PCR所得的OPN与TIP30的mRNAΔ CT值，采用Spearman秩相关性分析，得出18例口腔鳞癌组织标本中OPN与TIP30的相关系数r=-0.246（P=0.040）；两者存在一定的负相关性，但不明显。6、18例癌旁组织标本OPN与TIP30相关性分析利用RT-PCR所得的OPN与TIP30的mRNAΔ CT值，采用Spearman秩相关性分析，得出18例癌旁组织标本中OPN与TIP30的相关系数r=-0.477（P=0.034）；两者之间负相关性明显。7、70例口腔鳞癌石蜡标本OPN与TIP30相关性分析利用En VisionT M法所得的OPN与TIP30的表达蛋白IOD值，采用Spearman秩相关性分析，得出70例口腔鳞癌组织石蜡标本中OPN与TIP30的相关系数r=-0.255（P=0.033）；两者之间负相关性明显。8、20例正常口腔黏膜石蜡标本OPN与TIP30相关性分析利用En VisionT M法所得的OPN与TIP30的表达蛋白IOD值，采用Spearman秩相关性分析，得出20例正常口腔黏膜石蜡标本中OPN与TIP30的相关系数r=-0.489（P=0.029）；两者之间负相关性明显。实验结论：1、在口腔鳞癌组织中，OPNmRNA呈高表达，TIP30mRNA呈低表达，与癌旁组织对照具有明显的差异。这一结果表明癌肿是以促进增殖为主的。2、70例口腔鳞癌石蜡标本中，OPN、TIP30蛋白表达量与口腔鳞癌中mRNA表达情况一致，且在临床分期及淋巴结转移病例中有明显差异。两者对口腔鳞癌的增殖和转移可能有一定的相关性。3、用统计学的方法，通过对两种不同来源的标本分别进行OPN、TIP30的相关性分析，两者具有一定的负相关性，70例口腔鳞癌石蜡标本更明显。

骨桥蛋白与TIP30在口腔鳞癌中的表达及相关性研究

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