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大白菜霜霉菌诱导抑制性消减cDNA文库的构建及防御相关基因的表达分析

作　者: 唐永洽
导　师: 朱月林；张凤兰
学　校: 南京农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 大白菜 霜霉病 抑制性消减文库 病程相关蛋白 实时荧光定量PCR
分类号: S436.341
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


大白菜[Brassica campestris L. ssp. Pekinensi (Lour.) Olsson]是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一,并逐渐成为世界性蔬菜作物。大白菜霜霉病是由霜霉菌(Peronospora parasitica)引起的,从苗期到包心期或种株开花到结荚期均易发病,该病的发生会严重影响大白菜的产量及品质,因此研究大白菜抗霜霉病机理对大白菜的育种工作具有重要意义。本研究以抗霜霉病大白菜为材料,构建了霜霉病诱导表达的正向抑制性消减文库,研究了大白菜在霜霉病诱导下的差异表达基因；同时采用PCR技术克隆了5个防御基因的片段,通过应用荧光定量的方法研究了它们在侵染霜霉菌后的表达情况,为进一步揭示大白菜霜霉病抗性的分子机制及分子标记辅助育种打下良好基础。主要研究结果如下：1.以抗霜霉病DH系T12-19为材料,分别用接种大白菜霜霉病菌和喷蒸馏水0、6、12、24、48和72 h的双链cDNA混合池作为Tester和Driver,构建正向消减cDNA文库。经蓝白斑筛选,文库的重组率为87.3%,获得阳性克隆768个。文库的插入片段分布在200-1000 bp,主要集中在200-500 bp。2.利用反向Northern斑点杂交技术对正向文库的768个阳性克隆进行了筛选,共获得57个病原菌诱导上调表达的克隆；测序后得到55条通读EST；对这些EST序列进行聚类和拼接分析,共获得50个unigenes;经BLAST比对结果表明,37个unigenes与已知基因高度同源,占全部非重复序列的67.3%；对已知功能基因进行功能分类,发现这些基因的功能主要涉及物质与能量代谢、转录调控、蛋白质合成与代谢、膜及转运、信号转导、抗病防御等。此外,采用实时荧光定量PCR技术分析了文库中3个克隆在霜霉菌诱导下的表达谱,结果表明,这3个克隆在接种病菌6h后明显上调表达,与反向Northern斑点杂交结果基本一致。3.采用PCR同源扩增技术克隆了5个候选防御基因PR-1、PR-2(β-1,3-glucanase)、PR-5(thaumatin like)、PAL和F3H的cDNA片段。利用荧光定量PCR技术分析了这些防御基因在接种霜霉菌后的表达情况。结果表明,霜霉菌诱导后,2个编码病程相关蛋白的基因BRPR1和BRPR5在接种霜霉菌12h后明显上调,而BRPR2在接种霜霉菌6h后明显上调,之后逐渐恢复到正常水平；编码苯丙氨酸解氨酶的基因BRPAL在接种病菌6h后明显上调,12h后下调表达；花青素早期合成相关基因BRF3H在接种霜霉菌后的表达水平相比0h下调表达,但是与6 h、12 h、24h喷水对照相比没有明显的变化,48h后又恢复到正常水平。

全文目录


目录  4-6摘要  6-8Abstract  8-10缩略词表  10-11前言  11-13第一章 文献综述  13-20  1 霜霉病菌的保存及侵染规律  13  2 芸薹属抗霜霉病分子生物学研究  13-14  3 植物病程相关蛋白  14-15  4 差减杂交技术  15-17    4.1 SSH在植物发育相关基因方面的应用  15-16    4.2 SSH在非生物胁迫方面的应用  16    4.3 SSH在植物抗病机理研究方面的应用  16-17  5 实时荧光定量PCR  17-20    5.1 荧光定量PCR的检测方法  17-18    5.2 实时荧光定量PCR在病原菌检测中的应用  18-19    5.3 实时荧光定量PCR在抗病相关基因表达分析方面的应用  19-20第二章 大白菜霜霉菌诱导抑制性消减cDNA差减文库的构建和分析  20-47  1 材料与方法  21-34    1.1 材料  21-22    1.2 病原菌接种及样品取样  22    1.3 试验方法  22-34      1.3.1 叶片总RNA的提取  22      1.3.2 DNAase Ⅰ纯化总RNA  22      1.3.3 SSH文库的构建  22-29      1.3.4 反向Northern斑点杂交验证  29-33      1.3.5 阳性克隆的测序和序列分析  33      1.3.6 荧光定量PCR  33-34  2 结果与分析  34-44    2.1 大白菜叶片总RNA完整性及纯度检测  34-35    2.2 接头连接效率的检测  35-36    2.3 差减与未差减产物的两轮PCR  36    2.4 差减效率的检测  36-37    2.5 文库插入片段大小的鉴定及重组率的计算  37    2.6 探针标记效率的检测  37-38    2.7 反向Northern斑点杂交  38-39    2.8 差异克隆序列功能分类  39-41    2.9 荧光定量PCR检测分析  41-44  3 讨论  44-47第三章 大白菜霜霉菌诱导5个防御相关基因片段的克隆与表达分析  47-57  1 实验材料与病菌接种  48  2 防御基因的分离和扩增  48-50  3 防御基因的序列比对和表达分析  50-51  4 结果与分析  51-55    4.1 防御基因的序列比对分析  51-52    4.2 防御基因实时荧光定量PCR分析  52-55  5 讨论  55-57全文结论  57-59创新之处  59-61参考文献  61-69攻读硕士期间发表的文章  69-71致谢  71

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 蔬菜病虫害 > 白菜类病虫害 > 大白菜病虫害
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