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黑素瘤三维培养模型的建立及肉桂醛抑制黑素瘤细胞增殖和侵袭的实验研究

作　者: 周凌
导　师: 伍津津
学　校: 第三军医大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 恶性黑素瘤肉桂醛组织工程皮肤二维培养三维培养增殖细胞周期凋亡侵袭血管内皮细胞生长因子基质金属蛋白酶-9 细胞核增殖抗原跨膜糖蛋白E钙连接素角质形成细胞成纤维细胞
分类号: R739.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

恶性黑素瘤(malignant melanoma, MM)是一种高度恶性的肿瘤，是皮肤肿瘤中侵袭性和致死性最强的一种，严重威胁人类生命健康。恶性黑素瘤无限增殖和侵袭性生长是决定其临床预后的关键因素。因此研究恶性黑素瘤细胞的生物学特点，寻找有效抑制其增殖和侵袭的方法，是恶性黑素瘤防治研究的重要切入点。二维培养是研究黑素瘤细胞生物学特性的主要手段，能直观和便利地反映黑素瘤细胞的一部分生物学特性，但因缺少细胞-细胞间和细胞-基质间的相互作用和信息交流，黑素瘤细胞的部分特性与在体时比较存在差异，不能全面反映黑素瘤细胞的生物学特性。而三维培养提供的空间结构和生长环境可模拟体内的情况，能更真实地反映细胞-细胞间和细胞-基质间的相互作用。本实验室已在体外成功构建了复方壳多糖组织工程皮肤，在此基础上建立黑素瘤的体外三维培养模型，对于研究恶性黑素瘤的生物学特性以及进行药物疗效评价更具优势。目前多种不同的黑素瘤细胞株已被分离培养，并用于黑素瘤的生物学特性研究，本研究使用的A375细胞具有较强侵袭能力，是皮肤黑素瘤细胞株中具有代表性的一种。肉桂醛是一种醛类有机化合物，除了作为食品添加剂外，也具有抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等医药效应。本实验首先在二维培养条件下观察了肉桂醛对人皮肤黑素瘤A375细胞增殖、凋亡和侵袭的影响，然后在实验室原有组织工程皮肤的基础上加入A375细胞，建立黑素瘤三维培养模型，进一步检测了肉桂醛在三维培养条件下对A375细胞增殖和侵袭的影响。本研究方法、结果和结论分述如下：方法：1、A375细胞体外扩增，贴壁生长近融合后，在培养基中分别加入0（对照组）、10、20和40μM肉桂醛溶液，MTT法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，ELISA、western blot法检测VEGF表达水平，明胶酶谱法检测MMP-9分泌水平，细胞划痕实验检测细胞迁移，transwell实验检测细胞侵袭情况。2、将A375细胞加至复方壳多糖胶原凝胶的支架内行三维培养，在培养基中分别加入0（对照组）、10、20和40μM肉桂醛溶液，MTT法检测细胞增殖情况， ELISA、western blot法检测VEGF表达水平，明胶酶谱法检测MMP-9分泌水平。3、分别在组织工程皮肤基质表面和基质中接种A375细胞，进行气-液面交界培养或浸没培养，HE染色观察A375细胞生长情况，选择最合适的接种方式和培养方法，以便构建符合体内实际情况的黑素瘤三维培养模型。4、采用二步酶分离方法分离培养KC、FB，并连续传代。在组织工程皮肤基础上加入A375细胞，在培养第5、10和15天固定组织工程皮肤标本，HE染色观察A375细胞生长和侵袭情况，透射电镜观察A375细胞生长形态，免疫组织化学观察E-Cadherin、PCNA、MMP-9表达情况。5、皮肤恶性黑素瘤三维培养的第5天开始在培养基内分别加入肉桂醛溶液，培养第10、15天固定组织工程皮肤标本，HE染色观察A375细胞生长和侵袭情况，免疫组织化学观察PCNA、MMP-9表达情况。6、二维和三维培养的A375细胞经肉桂醛处理后，基因芯片检测氧化应激相关基因表达，ELISA法检测NF-κB活化情况。结果：1、肉桂醛能促进A375细胞凋亡，降低细胞增殖指数。10μM肉桂醛作用24小时即能抑制A375细胞增殖，10、20、40μM肉桂醛间的抑制强度具有统计学意义（P＜0.01）。40μM的肉桂醛作用72小时后细胞增殖抑制率最高，达88.91±4.5%。与对照组（0μM）相比，40μM肉桂醛作用后A375细胞增殖指数最低（53.38±4.25%vs35.13±3.24%），细胞凋亡百分比最高（4.37±0.25%vs10.50±0.37%）。各浓度间作用差异具有统计学意义（P＜0.05）。肉桂醛能抑制三维支架内A375细胞的增殖，促进其凋亡，10、20、40μM肉桂醛间的抑制强度具有统计学意义并呈剂量依赖性（P＜0.01）。2、肉桂醛能抑制A375细胞的迁移，也能抑制A375细胞的侵袭，抑制强度和肉桂醛浓度成正比，各浓度间作用差异具有统计学意义（P＜0.05）。3、肉桂醛作用后二维和三维支架内A375细胞VEGF的蛋白表达下降（2D：1.193±0.195vs0.204±0.017；3D：1.549±0.214vs0.392±0.019），各浓度间的抑制作用具有统计学意义（P＜0.01）。MMP-9的分泌也减少（2D：24885.83±865.80vs14150.77±555.63；3D：29408.50±817.62vs15121.43±497.95）。各浓度肉桂醛间的抑制强度差异具有统计学意义（P＜0.05）。4、在组织工程皮肤表面接种A375细胞行气-液面交界培养是最合适的黑素瘤三维培养方式和方法。在培养第5天即观察到A375细胞向真皮侵袭，随培养时间延长，A375细胞侵袭深度越深，第15天皮肤分化良好，大量A375细胞团块向真皮深部侵袭。肿瘤细胞生长良好，细胞核异形，细胞器丰富。肿瘤细胞E-Cadherin表达缺失，MMP-9和PCNA表达强度随侵袭深度增加而增强，在培养第5天、10天和15天间的表达强度均具有统计学差异(P＜0.05)。PCNA的阳性率在培养第5天、10天和15天间均具有统计学差异(P＜0.05)。5、肉桂醛能抑制三维培养模型内恶性黑素瘤A375细胞的增生和侵袭。肉桂醛作用后A375细胞数目减少，侵袭深度变浅，微弱表达PCNA和MMP-9。肉桂醛处理前后PCNA和MMP-9的表达也具有统计学差异(P＜0.01)。6、肉桂醛能抑制二维和三维培养的A375细胞的NF-κB活化，并促进抗氧化基因的表达。结论：本实验室成功构建了黑素瘤三维培养模型（即肿瘤组织工程），具有稳定性好，可控性高等特点，保留了恶性黑素瘤细胞增殖和侵袭的生物学特性，可作为研究黑素瘤生物学特性以及进行治疗黑素瘤药物疗效评价的模型。肉桂醛能显著抑制体外二维和三维培养模型中恶性黑素瘤细胞的增殖和侵袭，可能成为治疗早期恶性黑素瘤的化学抗癌剂。

黑素瘤三维培养模型的建立及肉桂醛抑制黑素瘤细胞增殖和侵袭的实验研究

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