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齐墩果酸衍生物介导的白血病细胞K562的细胞凋亡及与Akt信号通路的关系

作　者: 潘姝花
导　师: 许传莲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 齐墩果酸衍生物抗肿瘤活性细胞凋亡 Akt1 In Cell Analyzer
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

随着恶性肿瘤的发病率和死亡率的不断增加，抗肿瘤药物的研发成为当今生物医学界面临的重大课题。由于天然抗肿瘤药物具有高效、低毒等优点，所以从天然产物中筛选出有效的抗肿瘤药物是药物研发的重要手段。五环三萜类化合物在抗肿瘤药物的发展中起到不可忽视的作用。齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）是天然的五环三萜类化合物之一，已经用作抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗炎制剂等。最近，许多齐墩果酸衍生物主要是针对齐墩果酸C3、13位双键、A环和C28等官能团的结构修饰，以提高齐墩果酸衍生物的抗肿瘤活性和降低其对正常细胞的毒害作用。本研究对已合成的2-氨基嘧啶齐墩果酸（化合物4）和1，2-噁唑齐墩果酸（化合物5）的抗肿瘤作用机制研究如下：1）利用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测化合物4、5对K562细胞的细胞毒性作用。化合物4采用10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM，化合物5采用20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM6个浓度，以紫杉醇为阳性对照。K562细胞在不同浓度化合物下孵育72h后检测在490nm吸收值。结果显示化合物4、5显著抑制K562细胞的增殖，并呈浓度依赖的方式，IC50值分别为32.686μM和39.252μM。2）检测化合物对K562细胞形态学的影响。化合物4、5（20μM、40μM）处理K562细胞24h后，用Hoechst33342工作液染色30min，于荧光显微镜下看肿瘤细胞形态。结果显示化合物处理后，出现凋亡小体、核固缩、核裂解等细胞凋亡的典型特征。由此初步推测目的化合物通过凋亡途径抑制了K562细胞的增殖。3）采用流式细胞术检测化合物对K562细胞周期的影响。化合物4、5（40μM）处理细胞24h后，细胞用PI（50μg/mL）避光染色30min。流式细胞术检测结果显示化合物4、5处理细胞后，G1期细胞从29.89%（对照）分别增加41.65%和42.15%，初步推断化合物抑制细胞增殖与细胞周期阻滞在G1期有关。4）利用Western blot的方法检测化合物对Bcl-2、Bax和聚ADP核糖聚合酶（PARP蛋白）、pAkt1表达的影响。化合物4、5以20μM、40μM、60μM的浓度处理K562细胞36h后，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，裂解PARP蛋白，抑制pAkt1蛋白的表达。5）通过In cell analyzer1000分析稳转表达Akt1-EGFP的CHO细胞中Akt1在细胞内的分布情况。化合物4、5处理细胞1h后，加入16.7nM胰岛素，处理10min。利用In Cell Analyzer1000平台，高通量的捕捉并统计荧光标记的蛋白的数量及位置变化。发现化合物4、5以浓度依赖的方式抑制胰岛素刺激Akt1转移到膜上，从而影响Akt1在膜上磷酸化。6）构建重组载体pLJM1/Akt1，用嘌呤霉素筛选稳定过表达Akt1的K562细胞和Bel-7404细胞，利用MTT比色法检测目的化合物对其细胞毒性作用。结果显示化合物4、5通过浓度依赖的方式抑制细胞的增殖，IC50值分别为41.629μM和43.735μM。初步实验结果阐明该化合物具有一定逆转肿瘤细胞耐药性的潜在作用。本论文为齐墩果酸衍生物的结构优化提供了先导化合物和实验依据，为深入研究抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的分子作用机制提供了理论依据，为下一步新药的开发奠定基础。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略表  12-18
第一章绪论  18-26
  1.1 天然抗肿瘤药物概述  18-19
  1.2 五环三萜类衍生物的结构类型  19-22
    1.2.1 齐墩果烷型  19-20
    1.2.2 乌苏烷型  20
    1.2.3 羽扇豆烷型  20-21
    1.2.4 木栓烷型  21-22
  1.3 五环三萜类衍生物的研究现状  22-23
  1.4 五环三萜类化合物抗肿瘤作用机制的研究进展  23-24
    1.4.1 诱导细胞凋亡  23
    1.4.2 阻遏细胞周期  23
    1.4.3 抗肿瘤细胞侵袭  23-24
  1.5 Akt1 与肿瘤的研究现状  24
  1.6 研究内容及目的意义  24-26
第二章齐墩果酸衍生物体外抗肿瘤实验  26-40
  2.1 引言  26
  2.2 材料、试剂和仪器  26-27
    2.2.1 细胞株  26
    2.2.2 材料  26
    2.2.3 试剂  26-27
    2.2.4 仪器  27
  2.3 实验方法  27-30
    2.3.1 样品的配制  27-28
    2.3.2 细胞培养  28
    2.3.3 化合物 4、5 对 K562 细胞毒作用  28
    2.3.4 Hoechst 33342 荧光染色  28
    2.3.5 流式细胞术分析化合物 4、5 对 K562 细胞周期的影响  28-29
    2.3.6 提取细胞总蛋白  29
    2.3.7 细胞总蛋白定量（BCA 蛋白浓度测定试剂盒）  29
    2.3.8 Western Blot 检测方法  29-30
    2.3.9 IN Cell Analyzor 分析方法  30
  2.4 实验结果  30-37
    2.4.1 化合物 4、5 对 K562 细胞毒作用  30-31
    2.4.2 Hoechst 33342 荧光染色结果  31-32
    2.4.3 流式细胞术检测细胞周期实验结果  32-33
    2.4.4 蛋白定量结果分析  33-34
    2.4.5 Western Blot 实验结果  34-35
    2.4.6 In cell analyzer  35-37
  2.5 讨论  37-40
第三章过表达 Akt1 细胞株 K562、Bel-7404 细胞的构建及鉴定  40-58
  3.1 引言  40-41
  3.2 实验材料、试剂和仪器  41-42
    3.2.1 实验材料  41
    3.2.2 实验试剂  41-42
    3.2.3 实验仪器  42
  3.3 实验方法  42-49
    3.3.1 引物设计  42
    3.3.2 模板制备  42-43
    3.3.3 RNA 反转录成 cDNA 制备  43
    3.3.4 目的片段 Akt1 的 PCR 扩增  43-44
    3.3.5 PCR 产物回收  44-45
    3.3.6 质粒 pLJM1 的提取  45
    3.3.7 双酶切  45-46
    3.3.8 酶切产物回收  46
    3.3.9 T_4链接酶连接  46
    3.3.10 转化  46-47
    3.3.11 质粒 PCR 鉴定  47
    3.3.12 双酶切鉴定  47-48
    3.3.13 测序鉴定  48
    3.3.14 pLJM1、pLJM1/Akt1、psPAX2、pMD2.G 天根试剂盒质粒大抽  48
    3.3.15 pLJM1、pLJM1/Akt1、psPAX2、pMD2.G 质粒浓度浓缩  48-49
  3.4 过表达 Akt1 的 K562、Bel-7404 稳定细胞株的构建及筛选  49-50
    3.4.1 293T、K562、Bel-7404 细胞培养  49
    3.4.2 慢病毒包装  49
    3.4.3 病毒包装成功与否鉴定  49-50
    3.4.4 病毒侵染及稳定株的筛选  50
    3.4.5 Western blot 检测方法  50
    3.4.6 化合物 4、5 对过表达 Akt1 的 Bel-7404 和 K562 细胞细胞毒作用  50
  3.5 结果  50-56
    3.5.1 模板制备  50-51
    3.5.2 目的产物扩增  51
    3.5.3 目的片段 Akt1 和载体 pLJM1 双酶切  51-52
    3.5.4 重组质粒 pLJM1/Akt1 的质粒 PCR 鉴定  52
    3.5.5 重组质粒 pLJM1/Akt1 的酶切鉴定结果  52-53
    3.5.6 测序鉴定结果  53-54
    3.5.7 pLJM1 与包装质粒共转染 293T 细胞  54-55
    3.5.8 Western blot 检测包装的慢病毒  55
    3.5.9 Western blot 检测目的蛋白 Akt1 的表达  55-56
    3.5.10 化合物 4、5 对过表达 Akt1 的 K562 细胞细胞毒作用  56
  3.6 讨论  56-58
第四章结论与展望  58-60
  4.1 结论  58
  4.2 创新点  58-59
  4.3 展望  59-60
参考文献  60-68
附录  68-71
致谢  71

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