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O-GlcNAc糖基化在神经疾病中的作用

作　者: 施建华
导　师: 吴士良
学　校: 苏州大学
专　业: 病理学和病理生理学
关键词: O-GlcNAc糖基化 AKT GSK-3 脑缺血凋亡 FoxO1 自噬阿尔茨海默病 Tau
分类号: R749.16
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

第一部分O-OlcNAc糖基化对Insulin-PI3K-AKT信号通路的调节目的：在不同细胞中研究O-GlcNAc糖基化对Insulin-PI3K-AKT信号通路的影响。方法：在HEK-293FT, HepG2, N2a细胞和原代培养的小鼠海马神经元过表达或下调O-GlcNAc糖基转移酶OGT,或使用调节O-GlcNAc糖基化修饰关键酶的抑制剂处理细胞,改变细胞内O-GlcNAc糖基化水平。利用免疫共沉淀的方法研究Insulin-PI3K-AKT信号通路中可以被O-GlcNAc糖基化的组成部分。采用蛋白免疫印迹技术分析不同细胞内O-GlcNAc糖基化对AKT和GSK-3β磷酸化和活性的影响。结果：1)在HEK-293FT细胞中,免疫共沉淀和蛋白免疫印迹分析显示,AKT和GSK-3β是Insulin-PI3K-AKT信号通路中受O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白。2)在不同培养条件下,改变HEK-293FT细胞的O-GlcNAc糖基化水平,影响PI3K-AKT信号通路。O-GlcNAc糖基化负性调控AKT的Thr308和Ser473磷酸化水平,改变其活性。降低细胞内O-GlcNAc糖基化,下调GSK-3β的Ser9的磷酸化,但升高细胞内的O-GlcNAc糖基化对GSK-3β的Ser9磷酸化没有影响3)在不同培养条件下,改变HepG2细胞的O-GlcNAc糖基化水平,对AKT的GSK-3β的磷酸化没有明显的影响。4)N2a细胞和原代培养的小鼠海马神经元,O-GlcNAc糖基化调节AKT的磷酸化,但对GSK-3β的磷酸化没有影响。结论：本研究显示O-GlcNAc糖基化对AKT和GSK-3β的调节具有蛋白特异性和细胞特异性。Insulin-PI3K-AKT在不同的器官、组织和细胞中,扮演着不同的角色,O-GlcNAc糖基化的调节也存在着不同的表现,在神经元细胞内,O-GlcNAc糖基化调节AKT的活性。第二部分O-GlcNAc糖基化在脑缺血中对细胞凋亡的影响目的：研究O-GlcNAc糖基化是否及如何引起细胞凋亡,探讨脑缺血早期升高的O-GlcNAc糖基化对细胞凋亡的影响。方法：蛋白质免疫印迹和组织免疫荧光染色分析小鼠大脑中动脉阻断(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)脑缺血模型不同时间O-GlcNAc糖基化改变和AKT的磷酸化水平。Caspase3的活性测定和Tunel测定检测小鼠脑缺血早期海马细胞发生凋亡情况。在培养的HEK-293FT细胞,过表达OGT或者shOGT下调OGT表达以改变细胞内O-GlcNAc糖基化水平,用MTT检测细胞活力,荧光染色观察细胞核的形态,AnnexinV/PI流式细胞仪检测凋亡细胞,蛋白质免疫印迹分析早期凋亡标志Caspase3的活化和PAPR的水解。利用免疫沉淀,定点突变,蛋白免疫印迹分析O-GlcNAc糖基化对AKT的影响,探讨O-GlcNAc糖基化是否通过调节AKT影响细胞凋亡。结果：1)蛋白质免疫印迹和组织免疫荧光染色结果显示,小鼠MCAO模型脑缺血早期海马组织O-GlcNAc糖基化升高,Caspase3活性增加,Tunel染色出现凋亡细胞。2) HEK293FT细胞内过表达OGT,细胞活力下降,细胞核浓缩,断裂,呈现凋亡样改变,流式细胞仪检测到更多的凋亡细胞,蛋白免疫印迹分析结果显示过上调细胞内O-GlcNAc糖基化,Caspase3激活,PARP蛋白被水解。3)AKT的Thr308和Ser473受O-GlcNAc糖基化修饰。过表达OGT升高O-GlcNAc糖基化,促进AKT的糖基化,下调AKT的活性,引起下游底物Bad磷酸化下降,进而活化Caspase3而引起细胞凋亡：过表达AKT,可以改善过表达OGT引起的细胞凋亡,但过表达AKT的突变体,则不能逆转OGT引起的细胞凋亡。4)缺血海马的O-GlcNAc糖基化水平和AKT磷酸化水平呈负相关。免疫沉淀AKT,缺血侧海马AKT的O-GlcNAc糖基化要比对照侧高。结论：AKT的Thr308和Ser473受磷酸化和糖基化双重修饰。在脑缺血的早期,由于应激反应,细胞内的O-GlcNAc糖基化增加,而使AKT的磷酸化及活性下降,磷酸化的BAD减少,经过系列反应,进而激活Caspase3,启动凋亡发生。因此,O-GlcNAc糖基化在脑缺血早期的细胞凋亡中可能起重要作用。第三部分阿尔茨海默病患者脑内F调的O-GlcNAc糖基化影响FOXO1介导的自噬和Tau病变目的：研究O-GlcNAc糖基化对转录因子FoxO1的功能进行调节,探讨阿尔茨海默病患者脑内下调的O-GlcNAc糖基化对FoxO1介导的tau病变的影响。方法：在HEK-293FT细胞过表达OGT或者shOGT下调OGT的表达,蛋白质免疫印迹技术检测O-GlcNAc糖基化对FoxO1的影响。利用蛋白合成和降解的抑制剂处理细胞,蛋白质免疫印迹和实时定量PCR研究O-GlcNAc糖基化调节FoxO1蛋白水平的途径。利用免疫沉淀技术研究FoxO1是否被O-GlcNAc糖基化修饰,及如何影响自身的降解。蛋白免疫印迹分析细胞核和细胞质中FoxO1,研究O-GlcNAc糖基化改变是否影响FoxO1的细胞分布。改变细胞内O-GlcNAc糖基化水平,检测FoxO1报告基因的荧光素酶活性,实时定量PCR检测FoxO1靶基因的表达,蛋白免疫印迹检测FoxO1对自噬的影响,研究O-GlcNAc糖基化改变是否影响FoxO1的活性。利用前脑神经元特异性敲除OGT小鼠,蛋白免疫印迹技术检测O-GlcNAc糖基化改变,AKT和foxO1的蛋白和磷酸化水平,以及自噬和蛋白酶体相关蛋白的水平,One trail物体识别,Morris水迷宫,Reversal Morris水迷宫检测OGT KO小鼠学习记忆功能变化。蛋白免疫印迹和免疫荧光染色分析AD患者脑内O-GlcNAc糖基化和FoxO1的蛋白水平,自噬相关蛋白水平,以及Tau的聚积。结果：1)改变HEK-293FT细胞的O-GlcNAc糖基化,不仅通过调节AKT的活性,而影响FoxO1蛋白的磷酸化水平,还改变FoxO1的蛋白水平。2)升高的O-GlcNAc糖基化抑制FoxO1经过泛素一蛋白酶体通路进行降解。3) FoxO1本身可以被O-GlcNAc糖基化修饰,当O-GlcNAc糖基化修饰增加后,自身的泛素化减少,经泛素—蛋白酶体途径的降解受到抑制。4) FoxO1的O-GlcNAc糖基化使得其转录活性增加,所调控的自噬功能增强,但不影响其细胞内分布。5)前脑神经元特异性敲除OGT的小鼠,O-GlcNAc糖基化和FoxO1水平均下降,其自噬功能下调。短时程和场景记忆能力下降。6)AD患者脑内O-GlcNAc糖基化水平、FoxO1的蛋白水平、P62蛋白水平的增加和LC3的下降提示自噬能力降低,AD脑内,FoxO1的蛋白水平与Tau聚积呈负相关。结论：转录因子FoxO1受O-GlcNAc糖基化修饰,增强其稳定性,在AD脑中,降低的O-GlcNAc糖基化水平,使FoxO1的稳定性下降而降解,受它调控的自噬功能下调,而使磷酸化和聚集的tau无法清除,形成神经纤维缠结,而导致神经退行性变。

全文目录

中文摘要  4-8
Abstract  8-13
前言  13-16
第一部分 O-GlcNAc糖基化对Insulin-PI3K-AKT信号通路的调节  16-38
  1. 材料和方法  16-22
  2. 结果  22-34
  3. 讨论  34-36
  4. 结论  36-38
第二部分 O-GlcNAc糖基化在脑缺血中对细胞凋亡的影响  38-70
  1. 材料和方法  39-49
  2. 结果  49-66
  3. 讨论  66-68
  4. 结论  68-70
第三部分阿尔茨海默病患者脑内下调的O-GlcNAc糖基化影响FOXO1介导的自噬和Tau病变  70-106
  1. 材料和方法  71-81
  2. 结果  81-101
  3. 讨论  101-104
  4. 结论  104-106
参考文献  106-116
综述  116-139
  参考文献  130-139
英文缩写词表(Abbreviation)  139-141
博士生期间完成的论文  141-143
博士生期间承担科研项目情况  143-144
致谢  144

O-GlcNAc糖基化在神经疾病中的作用

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