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CPEB4在人脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞株增殖、凋亡和侵袭力的影响

作　者: 胡红超
导　师: 焦保华
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: 人脑胶质细胞瘤 CPEB4 RNA干扰慢病毒载体细胞增殖
分类号: R739.41
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤，约占成人颅内肿瘤的35.26%-60.96%(平均44.69%)。由于其浸润性生长，在肿瘤与正常组织之间常无明显的边界，因此手术治疗难以彻底切除肿瘤组织。尽管我们努力尝试各种治疗方法，但是脑胶质瘤仍然无法治愈。这就要求我们为胶质瘤的治疗寻找新的策略。近年来，随着基因工程技术的发展，人们开始从分子生物学的角度探求脑胶质瘤的发病机制，脑胶质瘤的基因治疗逐渐受到关注。CPEB4是新近发现的胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（CPEBs）家族中的一员，是一种具有序列特异性的RNA结合蛋白，含有一个RNA识别基序和一个锌指结构，位于人染色体5q21区域，定位于细胞质，长度为7769bp。胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（CPEBs）于大约二十年前被首次发现在卵母细胞成熟过程中，其在已确定的信使RNA的翻译过程中起着重要的调控作用，人们在早期做了很多关于CPEB控制胞质多聚腺苷酸化和翻译的工作，发现CPEB通过调控mRNA这一活动而影响诸多进程如生殖细胞的发育、细胞分裂与细胞衰老、突触可塑性以及学习与记忆等。然而，关于近年CPEBs的一些热点研究表明它不仅在体细胞组织表达，而且在控制成年有机体时间和空间的基因表达方面具有重要的功能。这些新发现的功能包括调节衰老和增殖之间的平衡，及肿瘤的发生等。CPEBs在各种组织和肿瘤中高度表达，且有部分重叠。最近的一项新研究表明，CPEB4在胰腺癌和胶质母细胞瘤中高度表达，这与肿瘤的生长、恶性度的增加及血管生成等有关。然而，CPEB4在脑胶质瘤中的表达没有被详细描述。鉴于以上研究背景，我们通过施行免疫组织化学、蛋白免疫印迹以及实时荧光定量PCR等实验方法，检测了CPEB4在正常脑组织和不同级别脑胶质瘤的蛋白及RNA水平的表达情况。此外，应用RNA干扰技术敲减胶质瘤细胞系中CPEB4的表达，来探究其在胶质瘤细胞增殖、凋亡和侵袭中的作用。本实验研究包括以下三个部分：第一部分: CPEB4在人脑胶质瘤组织中的表达及其临床意义目的：探讨CPEB4在正常脑组织中和各级别脑胶质瘤组织中的表达情况。方法：1收集样本:收集2011年10月至2012年11月期间在河北医科大学第二医院住院，经行手术切除的63例脑胶质瘤组织及9例正常脑组织。肿瘤标本均由神经病理医师确诊，正常脑组织取自脑出血或脑外伤需行内减压术的患者。每例患者分两部分留取标本，一部分置于10%福尔马林液中固定，另一部分保存于2ml无菌冻存管并立即投至液氮中速冻。2应用免疫组织化学法检测:9例正常脑组织及63例胶质细胞瘤组织中CPEB4蛋白的表达情况，并比较其表达差异，分析其与脑胶质瘤病理级别的相关性。3应用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time qPCR）测定CPEB4mRNA的表达水平。4应用蛋白质免疫印迹Western blot检测正常脑组织及胶质瘤组织中CPEB4蛋白的表达。结果：1免疫组织化学结果：CPEB4在胶质细胞瘤组织中的总阳性表达率为88.89%(56/63)，CPEB4在9例正常脑组织中表达呈阴性或很弱，脑胶质瘤组织的CPEB4阳性表达率明显高于正常脑组织，具有显著的统计学意义（P＜0.01）；低级别（I、II级）和高级别（III、IV级）胶质瘤组织阳性表达率分别为75%（15/20）和95.4%（41/43），差异具有统计学意义（P＜0.05）。2Western blot结果：CPEB4蛋白在脑胶质瘤组织中的表达明显高于正常脑组织。 CPEB4蛋白在正常脑组织及I、II、III、 IV级脑胶质瘤中相对表达量分别为0.070±0.012,0.417±0.044,0.495±0.043,0.709±0.080,0.713±0.027。CPEB4蛋白在低级别（I、II级）脑胶质瘤中的表达量低于高级别（III、IV级）（P＜0.05）。3Real-time qPCR结果：CPEB4mRNA在正常脑组织、低级别及高级别中相对表达没有统计学差异（P＞0.05）。结论：1免疫组化与Western blot检测均得出CPEB4蛋白在人脑胶质瘤组织中高度表达，并且其表达随着胶质瘤病理级别的增高而增加，III、IV级脑胶质瘤中CPEB4蛋白表达要高于I、II级脑胶质瘤，差异显著；但是，在mRNA水平，CPEB4的表达却无明显差异。对于这种蛋白水平与RNA水平表达不一致的情况，我们分析可能是与此RNA的稳定性差、易降解有关。2CPEB4的高表达与胶质瘤级别的升高呈显著的正相关，可作为脑胶质瘤临床分级的重要指标。第二部分: CPEB4在人脑胶质瘤细胞株U87、U251中的表达目的：检测CPEB4在人脑胶质瘤细胞株U87和U251中的表达情况，选出CPEB4表达量较高的细胞株以进行进一步的生物学功能试验。方法：1应用蛋白质免疫印迹Western blot检测U87和U251细胞中CPEB4蛋白表达情况。2应用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time qPCR）测定U87和U251细胞中CPEB4mRNA的表达。结果：人脑胶质瘤细胞株U87的CPEB4蛋白和mRNA均高于U251（P＜0.05）。结论：U87细胞株可被选择作为CPEB4的优势表达株，进一步行以CPEB4为研究靶点的生物学功能试验第三部分CPEB4慢病毒载体感染人脑胶质瘤细胞株U87及其对U87细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响研究目的：构建CPEB4干扰慢病毒载体，以构建好的CPEB4siRNA干扰慢病毒载体感染U87细胞株，探讨RNA干扰(RNAinierference，RNAi)对胶质瘤细胞株U87中CPEB4表达的抑制作用及其对U87细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响。方法：1构建CPEB4干扰慢病毒载体：针对目的基因CPEB4的序列信息，严格按照RNA干扰序列设计原则，设计3个RNA干扰靶点序列，合成SiRNA并向U87细胞分别转染3种si RNA，利用western blot筛选干扰效果最佳的siRNA，根据此siRNA序列，合成双链DNA Oligo，两端带有BamHI和ECORI酶切位点粘性末端，退火后得到的双链产物无需酶切可直接连入BamHI和ECORI线性化的pSRL-SIH1-H1-GFP载体。将连接产物转入细菌感受态细胞，提取细菌培养物中的质粒，对长出的克隆抽提质粒并酶切鉴定，然后进行测序比对,鉴定阳性克隆即为构建成功的CPEB4RNA干扰慢病毒载体。2在体外应用RNA干扰技术以siCPEB4(CPEB4SiRNA)靶向感染胶质瘤细胞株U87，分为转染组、阴性对照组和空白对照组；3应用Western blot和Real time qPCR分别检测CPEB4-siRNA慢病毒感染U87细胞后1天、2天、3天、4天、5天细胞中CPEB4蛋白和mRNA相对表达量变化；4应用流式细胞技术（FCM）检测CPEB4SiRNA慢病毒感染U87细胞后的细胞周期变化，并检测分析转染前后细胞凋亡水平变化；5应用MTT比色实验检测分析感染CPEB4-SiRNA慢病毒1天、2天、3天、4天、5天、6天及7天后U87细胞的增殖情况；6应用Transwell侵袭实验检测分析转染前后细胞体外侵袭能力的变化。结果：1成功构建并包装了携带CPEB4基因的慢病毒表达载体，经过阳性克隆测序证实插入序列完全正确；2Western blot和Real time qPCR结果显示，慢病毒感染组的CPEB4蛋白和mRNA相对表达量明显低于空白对照组与阴性对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)；空白对照组与阴性对照组间表达无统计学差异(P>0.05)；3流式细胞仪检测细胞周期结果显示，相对于阴性对照组细胞以及空白对照组细胞，转染CPEB4siRNA慢病毒后U87细胞阻滞于G1期，S期细胞数相对较少；阴性对照组和空白对照组的U87细胞的细胞状态和细胞周期没有变化；流式细胞仪分析各组细胞的凋亡水平显示，相对于空白对照组细胞(0.13±0.08)%和阴性对照组细胞(0.47±0.12)%，U87细胞感染CPEB4si-RNA慢病毒后早期凋亡率增加，达(19.16±3.85)%，具有统计学差异(P<0.01)；4MTT检测细胞活性显示，从第三天起，与阴性对照组（0.476±0.048）和未转染组（0.495±0.031）相比，慢病毒感染组（0.42±0.05）细胞生长速度开始减慢，并具有统计学差异(P＜0.05)，且随感染时间的延长，抑制程度越来越明显。而未转染组与阴性对照组组之间无明显差异(P>0.05)。说明CPEB4siRNA对U87细胞生长增殖具有显著抑制作用；5Transwell侵袭试验结果显示，经CPEB4siRNA慢病毒感染后，U87细胞穿膜数量明显减少，低于阴性对照组及空白对照组，差异具有统计学意义。换句话说, CPEB4能够促进胶质瘤细胞的体外侵袭力。结论：CPEB4靶向转染能够有效敲减这个基因在人脑胶质瘤U87细胞系内的表达，使肿瘤细胞增殖和侵袭能力受到显著抑制，阻滞细胞周期，并促进其凋亡增加，为脑胶质瘤基因治疗提供了新的靶点。

全文目录

摘要  5-10
ABSTRACT  10-16
英文缩写  16-18
引言  18-20
第一部分 CPEB4 在人脑胶质瘤中的表达及临床意义  20-49
  前言  20
  材料与方法  20-34
  结果  34-35
  附图  35-40
  附表  40-43
  讨论  43-44
  小结  44-45
  参考文献  45-49
第二部分 CPEB4 在脑胶质瘤细胞株中的表达  49-62
  前言  49
  材料与方法  49-54
  结果  54-55
  附图  55-57
  附表  57-58
  讨论  58-59
  小结  59-60
  参考文献  60-62
第三部分 CPEB4 慢病毒载体感染人脑胶质瘤细胞株 U87 及其对细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响研究  62-99
  前言  62-63
  材料与方法  63-80
  结果  80-83
  附图  83-90
  附表  90-91
  讨论  91-95
  小结  95
  参考文献  95-99
结论  99-100
综述 CPEB4 抗肿瘤研究最新进展  100-106
  参考文献  103-106
致谢  106-108
个人简历  108

CPEB4在人脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤细胞株增殖、凋亡和侵袭力的影响

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