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SHH-N信号通路及其靶基因N-myc对神经干细胞增殖的影响

作　者: 刘东升
导　师: 张波
学　校: 大连医科大学
专　业: 外科学
关键词: 神经干细胞 SHH信号通路 N-myc 细胞增殖 靶基因
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


SHH在细胞和组织中对细胞增殖和细胞周期有着广泛的影响。在神经发育中,SHH调节神经管[2]的图式发育及神经祖细胞的增值和分化。神经干细胞是位于侧脑室室下区和海马齿状回颗粒下区具有可再生和多向分化能力的祖细胞,可分化成神经系统中的三系细胞:神经元,星型胶质细胞,少突胶质细胞。最近研究发现在端脑中SHH对维持神经祖细胞内环境与神经修复有重要作用,外源性SHH可引起神经干细胞的增值。尽管各种细胞分裂素,神经营养因子及其他分子可调节神经干细胞的增殖,但是调节神经干细胞增殖机制未被详细阐明。目前SHH导致的细胞增殖和瘤变的机制并不清楚。在大部分细胞中,SHH信号通路由SHH、Patched(Ptc)和Smoothed (Smo) 2个跨膜受体组成的受体复合物,蛋白激酶A及下游转录因子Gli家族(Glil、Gli2、Gli3)等组成。信号传导时,SHH和Ptc结合,Ptc-Smo复合物解离,Smo进入胞内,激活下游的转录因子Gli家族。1999年,Rowitch等报道,在体内脊髓前体细胞可通过SHH使脑室下区神经前体细胞保持增值并抑制其分化。2003年,Lai, K等报道发现从成年大鼠海马区分离的神经前体细胞高表达SHH受体Patched,同时外源性的SHH可诱导神经前体细胞呈SHH浓度依赖性增值。采用腺相关病毒载体转染体内海马区,神经前体细胞较对照组可见有3.3倍的增值。2003年,Machold等基因敲除大鼠SHH基因导致大鼠未成年时就发育畸形,海马区和脑室下区神经前体细胞显著减少。并且认为脑室下区神经前体细胞的减少归因于细胞的程序化死亡。证实了SHH对神经干细胞生态位的维持起到重要作用,激活SHH信号通路可使发育成熟的脑组织内的神经前体细胞增殖。我们分离并纯化大鼠脑室下区神经干细胞,提取RNA、反转录PCR得到SHH-N的cDNA,克隆入pSNAV2.0 - CMV-IRES-EGFP,包装得到腺相关病毒rAAV–SHH -N–EGFP,感染神经干细胞48h后采用实时定量PCR检测SHH信号通路下游基因的mRNA水平变化。本实验的结果表明(1)克隆得到SHH-N基因,测序结果与NCBI报道序列一致。(2)成功构建pSNAV2.0-CMV–SHH–N–IRES-EGFP表达载体并鉴定,包装得到rAAV-SHH-N-EGFP。(3)实时定量PCR分析rAAV–SHH-N- EGFP感染神经干细胞48h后, rAAV-SHH-N-EGFP处理组较感染rAAV-EGFP的对照组,Gli1和N-myc的mRNA水平上调。2003年kenney[21]等报道在颗粒神经前体细胞中过表达N-myc可使G1期细胞周期蛋白表达上调,但颗粒神经前体细胞的增值并不依赖SHH信号通路激活。同时在体外培养的颗粒神经前体细胞中,激活SHH信号通路同时加入Myc拮抗物,可减少细胞增殖。由此,认为在颗粒神经前体细胞中,N-myc是SHH信号通路的靶基因,并调节细胞周期的蛋白的表达。总之,我们认为在神经干细胞中,N-myc是SHH信号通路的直接靶基因。由SHH过表达刺激后引起的N-myc转录因子表达上调,N-myc可能是SHH促进神经干细胞增值重要调控分子。尽管N-myc与Gli1的调控关系并未阐明,N-myc可能不依赖Gli1直接调控。N-myc在SHH信号通路的中调控细胞增殖的作用需要进一步研究。

全文目录


中文摘要  6-8英文摘要  8-10前言  10-12材料与方法  12-25  1. 实验材料  12-16    1.1. 菌株和细胞系及实验动物  12    1.2. 质粒载体  12-14    1.3. 工具酶及分子量标准  14    1.4.试剂盒  14-15    1.5. 主要化学试剂（按试剂公司分类）  15    1.6. 分析软件  15-16    1.7. 引物序列  16  2 实验方法  16-25    2.1. 神经干细胞的分离与原代培养  16    2.2. pSNAV2.0-CMV-SHH-N-IRES-EGFP 载体的构建与SHH-N 的测序与鉴定  16-23    2.3 .重组腺相关病毒rAAV2/1-SHH-N 的构建与包装  23    2.4. rAAV2/1-SHH-N 体外转染神经干细胞  23-24    2.5. Real-Time PCR 实验  24    2.6. 统计学方法  24-25实验流程  25-26实验结果  26-28  1. 神经干细胞的观察  26-27  2. 克隆得到SHH-N 编码序列并构建pSNAV2.0-CMV-IRES-EGFP 载体  27  3. SHH-N 在293T 细胞中表达  27  4. Western Blot 检测SHH-N 蛋白表达  27  5. 实时定量PCR 检测SHH 信号通路因子和靶基因的转录  27-28  6. rAAV-SHH-N-EGFP 转染NSCs 后EGFP 报告蛋白的表达观察  28讨论  28-30参考文献  30-34综述 神经干细胞自我更新调节相关信号通路与分子研究进展  34-44  摘要  34  Abstract  34-39  参考文献  39-44附录  44-45致谢  45

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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