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兔脂肪来源干细胞分离培养及富血小板血浆对其增殖的影响

作　者: 陈锦
导　师: 胡刚
学　校: 大连医科大学
专　业: 外科学
关键词: 脂肪间充质干细胞富血小板血浆细胞培养细胞增殖
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:自体脂肪移植已有上百年的历史,因其来源丰富、取材容易、操作简单、充盈外形好、无排异反应等优点,倍受整形美容外科医生的重视,但同时也存在不足之处,其中最主要是移植后脂肪细胞的成活率较低(<60%)。如何提高脂肪细胞的增殖及分化能力,是提高移植成活率的重要环节。随着脂肪组织工程的发展及研究,寻求来源广、易获取、损伤小、稳定扩增的种子细胞和无免疫反应、高效、廉价、配比协同作用好的生长因子是关键问题。目的:分离培养兔脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),并观察ADSCs体外生长的生物学特性及增殖分化潜能,探讨自体富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对ADSCs增殖的影响。方法:1.实验采用新西兰大白兔,取兔颈背部区脂肪垫,贴壁法及Ⅰ型胶原酶消化法体外培养兔ADSCs,观察其形态特征。2.取第3代ADSCs进行成脂、成骨诱导分化,两周后油红O成脂染色及三周后茜素红成骨染色鉴定。3.抽取兔心脏血,采用二次离心法制备PRP,并行全血及PRP血小板计数。4.将第3代细胞分为对照组(细胞180ul +单纯DMEM培养基20ul)、全血组(细胞180ul +全血血浆20ul)和PRP组(细胞180ul+ PRP 20ul),采用CCK-8法(Cell Counting Kit-8)检测不同作用时间(24h、48h、72h)各组对ADSCs增殖活动的影响。结果:1.原代培养的细胞24h后见少量椭圆形细胞贴壁,大部分未贴壁细胞为圆形的红细胞及筋膜杂质。48h首次换液,除去未贴壁的红细胞及筋膜杂质,见小部分贴壁细胞呈短梭形,其间也可见三角形、多角形细胞。3d后见部分细胞已贴壁伸展,呈长梭形,可见核分裂相,梭形细胞逐渐增多。7d后见细胞80%-90%融合,细胞呈漩涡样生长,大小不一,细胞多为长梭形成纤维细胞样。传代细胞4-6h即可贴壁,细胞形态与原代相似,细胞生长速度较原代细胞明显增快。2.细胞成脂诱导两周后油红O染色呈阳性,对照组为阴性;细胞成骨诱导三周后茜素红染色呈阳性,对照组为阴性。3.全血血小板计数为(313.0±137.5)×10~9/L, PRP血小板计数为(1267.0±760.2)×10~9/L ,PRP血小板计数是全血的4.08倍。4.CCK-8法显示PRP组在24h、48h、72h时较对照组增殖明显(P<0.01)。且在第24h、48h、72h时,与全血组有统计学差异(P<0.05)。结论:1.通过胶原酶消化法从兔颈背部区提取的脂肪组织分离得到的细胞,经鉴定证实为ADSCs。采用这种方法获得的细胞增殖迅速,可长期传代并维持稳定的增殖能力。2.ADSCs具有多向分化潜能,在特定条件下能够向成骨细胞、脂肪细胞方向诱导分化,可作为组织工程的种子细胞。3.通过二次离心成功提取兔PRP,血小板计数后,PRP的血小板计数控制在全血的4倍以上,二次离心法是制备PRP的有效方法。4.自体PRP对体外培养的兔ADSCs增殖有明显的促进作用。

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摘要 6-8Abstract 8-11前言 11-12材料和方法 12-15结果 15-20讨论 20-25结论 25-26参考文献 26-28综述 28-37 参考文献 34-37附录 37-38致谢 38

兔脂肪来源干细胞分离培养及富血小板血浆对其增殖的影响

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