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间日疟疾传播阻断疫苗候选抗原Pvs25在家蚕杆状病毒系统中的表达研究

作　者: 盛稳稳
导　师: 盛清
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 传播阻断疫苗 候选抗原 Pvs25 杆状病毒 表面展示技术 vBmCMV-gp64-Pvs25
分类号: R531.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


间日疟(Vivax malaria)是由间日疟原虫(Plasmodium vivax)引起的周期性发作的急性传染病，特点是间隔48小时反复发作。如今已有的抗疟疾药物也由于抗药性疟原虫以及耐杀虫剂传播蚊的出现而面临挑战。制备疟疾疫苗也就成为了能有效控制疟疾传播的主要手段。其中传播阻断疫苗（transmission blocking vaccines，TBVs）是以蚊虫阶段疟原虫特异表达的虫体表面蛋白作为抗原免疫人体，使之产生抗蚊阶段疟原虫表面蛋白的特异性抗体。间日疟传播阻断疫苗候选抗原Pvs25是疟疾研究的主要靶点，其在不同地区的疟疾病毒株间具有很高的保守性。Pvs25是在合子以及动合子表面表达的蛋白，分子量为25kDa，含有22个半胱氨酸形成的11个二硫键，序列含有4个类表皮生长因子结构域(EGF-like Domain)。本课题通过构建原核表达质粒pET-32a-Pvs25获得工程菌，经IPTG诱导后重组蛋白大量表达；从诱导菌体超声破碎后的上清中提取重组蛋白，经Ni亲和层析纯化后，获得重组蛋白纯度达到95%；将纯化后的重组蛋白免疫Balb/c雌鼠制备多克隆抗体；纯化后的抗体经间接ELISA测定效价为1：12800。同时，利用家蚕生物反应器平台的Bac-to-Bac系统成功获得重组杆状病毒vBm-Pvs25，感染家蚕细胞、家蚕五龄幼虫，Western Blotting分析结果显示，目的蛋白表达成功。构建BmCMV-gp64-Pvs25，在载体的多角体启动子前面串联一个CMV启动子序列，这样表达的重组蛋白Pvs25不仅可以在BmNPV的表面展示，而且可以在哺乳动物体内展示。获得重组杆状病毒vBmCMV-gp64-Pvs25，用于感染家蚕细胞，经SDS-PAGE、WesternBlotting分析、激光共聚焦观察，发现目的蛋白成功表达并展示于质膜表面。利用纯化得到的vBmCMVgp64-Pvs25病毒粒子免疫Balb/c小鼠获取抗血清，并对其免疫原性进行研究，结果表明其中和效价为1：25600，可以有效刺激机体产生免疫保护反应。本课题为间日疟传播阻断疫苗的进一步研究奠定了基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-12
缩略语  12-13
第一部分 文献综述与实验设计  13-23
  第一章 绪论  14-21
    第一节 疟疾疫苗的概述  14-17
      1.1 红前期疫苗  15
      1.2 红内期疫苗  15-16
      1.3 传播阻断疫苗  16-17
      1.4 展望  17
    第二节 间日疟传播阻断疫苗 Pvs25 研究进展  17-18
    第三节 杆状病毒研究进展  18-21
      3.1 家蚕核型多角体 BmNPV 表达载体系统  18-19
      3.2 家蚕杆状病毒表达系统的优势  19
      3.3 家蚕杆状病毒表面展示技术  19-21
  第二章 实验方案设计  21-23
    1 研究目的及意义  21
    2 研究内容  21-22
    3 实验流程图  22-23
第二部分 研究论文  23-63
  第一章 生物信息学分析  24-29
    1 生物信息学分析工具  24
    2 分析方法与结果  24-29
      2.1 Pvs25 基因序列  24-25
      2.2 CMV 的基因序列  25
      2.3 Pvs25 的疏水性分析  25-26
      2.4 Pvs25 的跨膜区预测  26-27
      2.5 Pvs25 的信号肽预测  27
      2.6 Pvs25 的二级结构预测  27
      2.7 Pvs25 的高级结构预测  27-28
      2.8 讨论  28-29
  第二章 间日疟传播阻断候选抗原 Pvs25 的原核表达  29-41
    1 材料和试剂  29-32
      1.1 材料和试剂  29
      1.2 试剂配制  29-32
    2 方法  32-38
      2.1 PCR 扩增目的片段  32-33
      2.2 PCR 产物与 pET-32a 载体的双酶切  33
      2.3 酶切产物回收  33
      2.4 Pvs25 基因和 pET-32a 质粒连接反应  33-34
      2.5 Rosetta 和 TG1 感受态细胞的制备  34
      2.6 连接产物的转化  34
      2.7 重组阳性克隆的鉴定  34-35
      2.8 重组菌的表达  35-37
        2.8.1 重组质粒的转化  35
        2.8.2 重组表达载体在大肠杆菌中的表达  35
        2.8.3 SDS-PAGE 电泳分析  35
        2.8.4 融合蛋白 Pvs25 的表达的 Western Blotting 鉴定  35-36
        2.8.5 融合蛋白 Pvs25 的大量表达和 Ni 柱纯化  36-37
        2.8.6 目的蛋白定量和浓缩  37
      2.9 多克隆鼠抗的制备  37-38
        2.9.1 免疫动物  37
        2.9.2 多克隆抗血清的制备  37
        2.9.3 抗体纯化  37
        2.9.4 抗体效价测定  37-38
    3 结果与分析  38-40
      3.1 Pvs25 基因的 PCR 扩增和表达载体 pET-32a-Pvs25 的构建  38-39
      3.2 pET-32a-Pvs25 的原核表达鉴定  39
      3.3 pET-32a-Pvs25 的原核表达纯化  39-40
      3.4 多克隆抗体的效价测定  40
    4 讨论  40-41
  第三章 间日疟传播阻断候选抗原 Pvs25 在家蚕杆状病毒系统中的表达  41-50
    1 材料与试剂  41-42
      1.1 材料与试剂  41
      1.2 试剂配制  41-42
    2 方法  42-46
      2.1 重组质粒 pFastBacHTB-Pvs25 的构建  42
        2.1.1 Pvs25 片段的 PCR 扩增  42
        2.1.2 pFastBacHTB 和 Pvs25 片段的双酶切  42
        2.1.3 连接反应  42
      2.2 重组病毒基因组 Bacmid-BmPvs25 的构建  42-44
        2.2.1 DH10Bac 感受态的制备  42
        2.2.2 重组质粒的转化  42-43
        2.2.3 重组 Bacmid 的提取  43
        2.2.4 重组 Bacmid 的鉴定  43-44
      2.3 重组病毒 vBmPvs25 的构建  44-45
        2.3.1 重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕 BmN 细胞  44-45
        2.3.2 重组病毒的 PCR 鉴定  45
        2.3.3 重组病毒的扩增以及病毒滴度测定  45
      2.4 重组蛋白 Pvs25 在家蚕 BmN 细胞中的表达和鉴定  45-46
      2.5 重组蛋白 Pvs25 在家蚕五龄幼虫中的表达和鉴定  46
        2.5.1 重组病毒 vBmPvs25 感染家蚕五齡幼虫  46
        2.5.2 Western Blotting 鉴定融合蛋白 Pvs25 的表达  46
    3 结果与分析  46-49
      3.1 重组质粒 pFastBacHTB –Pvs25 的构建的鉴定  46
      3.2 重组病毒 vBmPvs25 的鉴定  46-47
      3.3 Western Blotting 鉴定 Pvs25 蛋白在家蚕细胞中的表达情况  47-48
      3.4 Western Blotting 鉴定 Pvs25 在家蚕幼虫中的表达  48-49
    4 讨论  49-50
  第四章 Pvs25 蛋白的杆状病毒表面展示的研究  50-63
    1 材料与试剂  50
      1.1 材料与试剂  50
    2 方法  50-55
      2.1 引物设计与 Pvs25 基因的获得  50-51
      2.2 重组质粒 pFastBacDual-CMV-SP-TM 的获得  51
      2.3 重组质粒 pFastBacDual-CMV-SP-Pvs25-TM 的构建  51-52
      2.4 重组病毒基因组 Bacmid-CMV-gp64-Pvs25 的构建  52-53
        2.4.1 DH10Bac 菌感受态的制备  52
        2.4.2 重组质粒的转化  52
        2.4.3 重组 Bacmid 的提取  52
        2.4.4 重组 Bacmid PCR 鉴定  52-53
      2.5 重组病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的构建  53-54
        2.5.1 重组病毒基因组通过脂质体介导法转染家蚕 BmN 细胞  53
        2.5.2 重组病毒的基因组提取以及 PCR 鉴定  53-54
        2.5.3 重组病毒的扩增和重组病毒滴度测定  54
      2.6 目的蛋白 Pvs25 在家蚕 BmN 细胞中的表达和鉴定  54
        2.6.1 重组病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 感染家蚕 BmN 细胞  54
        2.6.2 Western Blotting 鉴定蛋白表达  54
      2.7 重组病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的大量扩增  54
      2.8 重组病毒粒子的纯化  54
      2.9 免疫细胞方法检测 vBmCMV-gp64-Pvs25 在家蚕细胞中的表达  54-55
      2.10 纯化的重组病毒粒子免疫小鼠  55
      2.11 抗体的效价测定  55
    3 结果与分析  55-61
      3.1 重组质粒 pFastBacDualCMV-gp64-SP-Pvs25-TM 的构建  55-57
        3.1.1 PCR 扩增 Pvs25 完整的 ORF 序列结果  55-56
        3.1.2 重组供体质粒 pFastBacDualCMV-gp64-SP-Pvs25-TM 的鉴定  56-57
      3.2 重组 Bacmid PCR 鉴定  57
      3.3 重组病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的鉴定  57-58
      3.4 Western Blotting 鉴定 Pvs25 蛋白在家蚕细胞中的表达  58-59
      3.5 免疫细胞方法检测 Pvs25 蛋白在家蚕细胞中的表达  59-60
      3.6 抗体的效价测定  60-61
    4 讨论  61-63
结论  63-64
参考文献  64-69
致谢  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 寄生虫病 > 原虫病 > 疟疾
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