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抗菌肽Shiva-1a基因在杆状病毒中表达及山羊转基因核供体细胞的制备

作　者: 许丹
导　师: 童德文
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 布鲁氏菌 抗菌肽 杆状病毒 细胞转染
分类号: S827
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 29次
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内容摘要


本研究目的旨在获得一种转基因山羊胎儿成纤维细胞,为培育抗布鲁氏菌病转基因山羊新品种提供材料。首先通过杆状病毒表达系统表达Shiva-1a抗菌肽,并对其抑菌活性进行检测。然后构建抗菌肽Shiva-1a淋巴特异性真核表达载体。最后通过转染细胞并筛选转基因山羊胎儿成纤维细胞。研究取得以下结果:1根据GenBank中公布的抗菌肽Shiva-1a的氨基酸序列,设计出昆虫细胞偏爱密码子的Shiva-1a基因,并将其克隆入BAC-TO-BACTM重组杆状病毒表达系统的pFastBac Dual载体中,成功构建重组转座载体pFastBac-Shiva-1a。重组转座载体转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,获得含重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-Shiva-1a。含重组杆状病毒穿梭载体转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,通过Tricine-SDS-PAGE和Western Blot检测,在5kDa处检测到抗菌肽Shiva-1a表达。体外抑菌试验结果表明,Shiva-1a对大肠杆菌具有抑菌活性。2通过PCR扩增出转录和翻译终止序列SV40 ployA、山羊基因组IL-2基因的信号肽序列及其5’端调控区,将其与抗菌肽基因Shiva-1a序列共同插入骨架载体pEGFP-C1中,构建成功能够非融合表达的淋巴细胞特异性真核表达载体pEGFP-PIS,经酶切鉴定载体构建正确。3利用脂质体将淋巴细胞特异性表达pEGFP-PIS载体转染至39 d的奶山羊胎儿成纤维细胞中,经700μg/mL的G418筛选后,获得阳性细胞克隆群落。经PCR鉴定,外源目的基因Shiva-1a已稳定整合于细胞基因组中。染色体核型分析表明,该转基因细胞染色体正常,可为后续细胞核移植试验提供材料。研究结果为进一步研究抗菌肽Shiva-1a生物学活性和培育转基因抗病羊奠定基础。

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 山羊
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